一、简介：
1细胞质膜资料
1895年,从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的糖类物质组成"。
1925年&:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由单层脂分子组成"。
1935年&：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三文治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。
1959年:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一上去
长度：2(暗)3.5(亮)2（暗）=7.5
细胞质膜的主要功能概括如下：
(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;
(2)选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；
(3)提供细胞辨识位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；
(4)为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；
(5)介导细胞与细胞、细胞与基质之间的联接;
质膜参与产生具有不同功能的细胞表面特化结构。
2膜蛋白
虽植物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁杂，多数膜蛋白分子数量较少，但却赋于细胞膜十分重要的生物学功能。
按照膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合形式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。
(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因而只要改变碱液的离子硬度甚至提升体温就可以从膜上分离出来，膜结构并不被破坏。
(2)内在膜蛋白与膜结合十分紧密，通常讲只有用去垢剂()使膜解后才可分离下来。
获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们变得十分的重要。
附注：使用分级抽提方式获得的“膜蛋白”中只有极少一部份是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，一直是蛋白组学的一个困局，不管采用２－Ｄ技术也好，ＩＣＡＴ乃至都还不能有效解决这一问题。
二、蛋白抽提
谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这种方式往往组合到一起对特定的物质进行分离纯化。因为蛋白质种类繁杂，不同的蛋白质因为结构和组成的差别，其溶化度也各不相同.按照蛋白质的溶化特点，同时可选择不同的溶剂提取，分为水碱液提取和有机溶剂提取.
然而针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方式就是用不同的离心速率除去胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放下来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，通常常用的有胆络合物，CHAPS(一种离子去污剂），和等表面活性剂。
1、分离膜蛋白的方式（原则性）：
1）先分离膜，之后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法促使细胞破碎，之后通过出家离心得到富含膜蛋白的粗组分。（比如：液氮碾磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。搜集37%与41%间的成份，即为质膜部份。裂解即可搜集膜蛋白）
2）用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶化出来，之后将蛋白质稳定.去垢剂的选择一般是根据他对所须要蛋白质的提取效率来确定，但在个别情况下，还要考虑到之后的纯化步骤.其实许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能须要去除去垢剂.
这往往会导致蛋白质失活，但若果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题.倘若不是用于测序的，可考虑使用才能粘附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可拿来溶化膜蛋白的去垢剂.但是，她们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶化方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如X-100在280nm处有吸收，假若某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应防止使用这类去垢剂.
将膜剂型与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜剂型上将所需的膜蛋白增溶出来.这些做法的用处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成份或染色质成份的混进.使用这些方式所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数目上，都比酸溶化法所得到的蛋白（
通常提取的膜蛋白量常常只占膜蛋白总数的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是十分重要的.第二种方式简单，可靠，但有时富含其他蛋白。通常的都是借助4度时所有的蛋白质原则上都溶于水碱液，在气温超过20度时，此碱液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。借助此性质可提取膜蛋白。
3)膜蛋白色谱(of,CMP)CMP分离强疏水性蛋白、多肽混和物的层析系统，通常有去垢剂（如SDS）溶化膜蛋白后产生SDS-融膜蛋白，并由甲基磷灰石为固定相的木柱分离纯化。甲基磷灰石柱具有阴离子乙酸官能团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。借助原子散射法研究cAMP的分离机制发觉，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷多肽与固定相中带电离子间的交换，进而达到分级分离的目的。
4)次序抽提法：按照细胞蛋白溶化性的差别，器具有不同溶化能力的蛋白溶化液进行抽提的方式。用Tris碱碱液裂解细胞提取高溶化性蛋白；把未溶化的用标准液溶化提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶化液，最后可以再度抽提前两次抽提后不能溶化的膜蛋白。
5)
原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨断裂后，超高速离心
评价：虽然分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,并且可溶性蛋白组分和膜蛋白组分之间依然有不少重复的点.该方式相较MP院士在1998年上发表的分级抽提法除以了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方式。（）
6)-based：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器(ER)，之后分级抽提方式。诸如，除去细胞器以后的就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部份。
总的体会：细胞的量要很充足。以后的定性鉴别常用的技巧有单向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀丙酯凝胶电泳等。纯化蛋白质含量的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴别膜蛋白，便捷迅速。
到目前为止，提取膜蛋白一直是蛋白学的一个困局。
2、分离膜蛋白的方式（操作）
1）分离细胞膜蛋白的方式：
1、冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于温度与液氮罐中反复冻融2次。
2、5000转4度离心，清除核及未裂解的细胞。
3、取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4、12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白含量,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
A:,,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/ml,20uMpmsf(PH=7.4)
B:,,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/ml,20uMpmsf(PH=7.4)1mMEGTA
C:0.5ug/ml,20uMpmsf,-cl(PH=7.0),
2）分离细胞膜蛋白的方式：
1、细胞置于冰上，除去上清，用pH7。4的冷乙酸盐缓冲液漂洗双层细胞两次
2、加入1ml2%碱液冰浴15min
3、刮下单层细胞，4度下10000g5min离心
4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，之后37度下2000g离心5min
5、收集水相留作剖析
6、用500ul冰凉的C溶化去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再度离心
7、按步骤8再度抽提去污剂相，用C将漂洗后的去污剂相稀释到初始容积
8、用等量的A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1、2%:2%、/LTrisHCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2、缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA）
3、C
/LTrisHCl(pH7.5)
/LNaCl
5mmol/LEDTA(PH7.5)
3）分离细胞膜蛋白的方式：
7Murea
2M
4%chaps
2.5%sb3-10
个细胞，可用此1ml。冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速高温离心30min。
取上清-20保存。
4）分离组织膜蛋白的方式：
1、取组织，加入10mlA于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机，4℃离心10min后，所得碱液转到超速离心管。
3、，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，台式离心机，4℃离心30min。
4、收集所得碱液即为膜组份。
A：0.32M蔗糖，5mMTris-HCl（PH7.5），120mMKCl，1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/ml,1ug/mlA,1ug/ml。冰上预冷。
B：20mMHEPES（PH7.5），10%甘油，2%X-100,1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/ml,1ug/mlA,1ug/ml。冰上预冷。
5）分离组织膜蛋白的方式：
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5去氧胆酸钠
0.1%SDS
以下用时加入
10mg/mlPMSF异戊烷（终含量10ul/ml）
（30ul/ml）
（10ul/ml）
冰冻组织100mg/细胞个，可用RIPA1ml。冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速离心30min，20000转高温离心最佳。
取上清-20保存。
6）分离真菌膜蛋白的方式：
1、于20ml营养鱼汤中过夜培养真菌，37℃，。
2、、20min、4℃离心，去上清。
3、20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心细胞膜色谱，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。
④超声波破碎真菌。
⑤3000g，10min、室温下离心除去未破碎真菌。当心汲取上清（富含胞质成份和真菌外被成份）。
⑥超速离心I：100,000g，60min，4℃，除去上清（胞质成份），搜集病菌外被成份。
⑦用10ml含2％的SLS的Tris-Mg缓冲液重悬沉淀物，温度温育20-30min。
⑧超速离心II：70,000g，60min，温度沉淀搜集外膜蛋白，除去上清（含细胞质膜）。重复⑦、⑧两步。
⑨充分吸除上清，并按照沉淀容积大小用0.1-0.2ml的ddH2O重悬沉淀物。依据公式：蛋白含量(mg/ml)=1.450D280-0.740D260测定外膜蛋白含量，调节蛋白含量至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。
试剂
①Tris-Mg缓冲液
10mMTris-Cl
5mMMgCl2
pH7.3，4℃保存
②2%(w/v)十二羰基肌氨酸钠(SLS)
7）来始于(1974)
1、取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。因为水与膜的疏水部份之间有反应，因而要精确把握分离介质中的离心硬度和渗透压，以每克细胞湿重加40ml介质。
2、用-匀浆器，杆与壁间间隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4～6次，每次5S。
3、过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部份加入50μl介质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部份再加入先前匀浆的碱液。
4、合并3次碱液细胞膜色谱，2kg离心10min，弃上清，沉淀部份溶于100μl介质，离心10min，弃上清，留沉淀。
5、将沉淀部份加入70%蔗糖15份，之后分别放在三个离心管中，前面依次叠加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖碱液各2、2、5、5、3份。
6、700kg离心90min，分离介质在1.16～1.18之间产生介面。
7、收集d为1.16～1.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min，漂洗2次。
8、保存于2.7mmol/LTris-HClpH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究剖析
8）常用的制备粗制质膜组分的方式：（所有操作都在4摄氏度下进行）
1.在冰凉的匀浆缓冲液中捣碎组织块，倒流血水。用匀浆缓冲液洗涤组织尸块，并将它们放在冰上，重复上述操作，直到组织碎成1mm3大小的碎片，且无可见的血。
2.加入5倍（容积比）与组织块容积的缓冲液，再放在冰浴的氏玻璃匀浆器中，抽研10-20次，匀浆组织。
3.匀浆4摄氏度600g离心10min，上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃沉淀。
4.上清4摄氏度8000g离心10min，沉淀线粒体。弃沉淀。
5.上清4摄氏度离心20min，弃上清。
6.用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再度4摄氏度，离心20min，弃上清。
7.用小容积的适合缓冲液重新彻底匀浆沉淀。
8.粗制的样品可于干冰/乙酸中速冻，保存于-80摄氏度。
9）用特殊的去污剂选择性的分离。
简单，可靠，但有时富含其他蛋白。
原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于水碱液，但在37度时，此碱液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。
方案
1、放射性标记受试细胞
2、将标记的细胞置于冰上
3、去除上清，用pH7。4的冷乙酸盐缓冲液漂洗双层细胞两次
4、加入1ml2%碱液冰浴15min
5、刮下单层细胞，4度下10000g5min离心
6、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，之后37度下2000g离心5min
7、收集水相留作剖析
8、用500ul冰凉的C溶化去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再度离心
9、按步骤8再度抽提去污剂相，用C将漂洗后的去污剂相稀释到初始容积
10、用等量的A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1）2%:2%、/LTrisHCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA）
3）C
/LTrisHCl(pH7.5)
/LNaCl
5mmol/LEDTA(PH7.5)
10）动物中：高度纯化的质膜是质膜蛋白研究的基础，制备纯化方式也好多，动物材料中以
1、蔗糖密度梯度离心、
2、水溶性双水相法、
3、自由流电泳等方式为主。