细胞膜(CMC)色谱技术细胞膜色谱法(CMC)的提出分子细胞生物学的研究表明,受体大分子主要镶嵌在细胞膜上,属于整合膜蛋白,其量极微,要得到微克数目级的纯品十分困难,所以无法制备纯受体固定相。而通过细胞膜制备技术得到含受体细胞膜的CMC法,除了可以克服上述困难,但是最大限度地保持受体分子的立体结构和生物活性,使该色谱系统更接近体内过程。定义:以含受体的细胞膜为固定相,借助溶质分子与相应受体大分子间特异性分子间斥力的不同进行分离测定的气相色谱技巧。贺浪冲,耿信笃.细胞膜色谱-研究抗生素与受体的新方式.生物医药色谱新近展,1996,3:8-9细胞膜色谱法(CMC)的提出基本假定(1)抗生素分子与受体间存在特异性亲合力。(2)膜受体大分子表面活性点数与抗生素分子有关。(3)活性点与抗生素可逆结合,并具有立体特异性和饱和性。(4)强溶剂及性质相仿的竞争性抗生素有置换抗生素分子的能力。(5)同类抗生素分子在同一受体上作用位点和硬度存在差异性。(6)抗生素在受体上的作用位点和硬度决定着受体的存在状态。贺浪冲,耿信笃.细胞膜色谱-研究抗生素与受体的新方式.生物医药色谱新近展,1996,3:8-9细胞膜色谱法基本原理CMC:将细胞膜结合到硅胶表面,制成细胞膜固定相(cellphase,CMSP),借助色谱学技术研究流动相中抗生素与受体互相作用规律的受体动力学新方法。
特点:①双重特点:色谱分离+受体亲和②特异性、饱和性:与放射官能团-受体剖析法(RLBA),前沿剖析(FA)进行对比和相关研究③稳定、简捷、高效捐助:8项国家自然科学基金1项国家自然科学基金重点项目仪器设备要求2.细胞膜色谱固定相3.仿生流动相1.膜受体/蛋白4.进样器色谱柱装弹细胞膜制备细胞膜固定相制备5.色谱剖析结果高效气相色谱仪器设备要求1.细胞膜制备主要设备冷藏高速离心机:>C超声波清洗机其他设备与器材制冰机涡旋振荡器电子天平pH计匀浆器仪器设备要求2.细胞固定相制备主要设备电热鼓风干燥箱真空泵涡旋振荡器磁力搅拌器高温冰柜(陈列柜)离心机其他设备与器材电子天平pH计匀浆用具支试管仪器设备要求3.色谱柱制备主要设备装柱机涡旋振荡器其他设备与器材高温冰柜(陈列柜)pH计空色谱柱套装仪器设备要求4.细胞膜色谱剖析溶剂输送泵主要设备进样器高效气相色谱仪柱温装置测量器其他设备与器材高温冰柜(陈列柜)pH计真空泵操作过程1.细胞膜制备新鲜组织清除血污及附属组织,剪碎,匀浆细胞悬液液组织匀浆液3000g离心10min细胞膜色谱,倾出碱液,取沉淀用低渗液混悬沉淀,并超声破膜30min破碎细胞悬液1000g离心10min,取碱液,离心20min,弃碱液细胞膜用低渗液漂洗1次,/LPBS混悬细胞膜悬液操作过程2.细胞固定相制备取活化处理后的大孔硅胶(加适量分散剂)0.05g,于25mL具支试管中,在减压和震动条件下,将5mL的细胞膜悬液动态加入,反应5min;将反应混和物转移至10mL离心管中,置4℃条件下搅拌30min后,500rpm离心5min,倾去碱液,沉淀用预冷的生理盐水漂洗1次,500rpm离心,弃去碱液,加等容积的10mmol/L磷络合物缓冲液(pH7.4),涡旋回落混匀细胞膜色谱,4℃放置过夜,即得细胞膜固定相悬液。
操作过程3.细胞膜色谱柱制备制备螺丝流速约2mL/min,调整流速,匀浆罐使装柱机柱前压力稳定在10MPa左右,维持5min。储液瓶流速调节表压力表装柱机柱套筛板细胞膜色谱的主要应用•用于从草药复杂体系中筛选出活性成份•用于草药复方的物质基础剖析•用于研究抗生素与受体的亲和作用•受体亚型抗生素的筛选细胞膜色谱联用技巧的提出原CMC法存在的问题随着对CMC法基础研究的深入和应用领域的扩大,急切须要对其进行“升级换代”的提升,并具备新的剖析功能。比如原CMC法中:第一,靶细胞是通过生物组织和通常培养方式获得的,靶细胞质膜上的“目标”受体抒发数目有限且不可控,促使对官能团辨识的灵敏性和选择性遭到了不同程度的限制;第二,靶细胞质膜上“目标”受体的低抒发,致使色谱固定相表面的非均匀性质提高,卟啉与膜受体间结合反应性减小,对复杂体系中微量或痕量成份的辨识有一定困难;第三,采用的单通道/单检查剖析系统,致使对活性成份的鉴别不能同步在线进行,系统的在线定性和定量功能相对较弱等。