(1．上海中医药学院第一临床医大学，浙江温州；2．上海中医药学院毒理教研室，湖南长沙；3．江苏学院理大学物理系，四川成都)
摘要：细胞膜色谱法是研究抗生素与受体之间互相作用的一种新型亲和色谱技术，将抗生素在体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟。随着CMC法研究的深入，为天然动物药中有效成份的提取细胞膜受体，草药复方的定性定量剖析等方面提供了实验根据，为研究抗生素与受体作用及创新抗生素的骁龙量筛选提供了细胞水平筛选平台。文章简略综述近些年来细胞膜色谱法及其在毒理学中的应用进展。
关键词：细胞膜色谱法；高效气相色谱法；有效成份；细胞膜；受体
中图分类号：R285文献标示码：A文章编号：1673-7717(2007)05-0983-03
细胞膜色谱法(cell，CMC)是贺浪冲院士创建的一种研究受体与抗生素互相作用的新型亲和色谱技术技巧，将高效气相色谱、细胞生物学与受体毒理学相结合，借助抗生素与膜受体间存在的特异性亲和力，成功地将抗生素在体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟。CMC法是将活性组织细胞膜固定在特定载体表面细胞膜受体，制备成细胞膜固定相(CMSP)。以缓冲碱液为流动相，抗生素为溶质或填加在流动相中，用气相色谱法在动态条件下研究抗生素与固定相上细胞膜及受体的互相作用。抗生素可不经提取分离步骤，直接在相应的CMC模型上完成筛选过程。而且抗生素在CMC模型中的保留特点(容量因子)和其抗生素的作用有明显的相关性。CMC方式具有操作简便、稳定可靠、高效灵敏的优点，其筛选系统为抗生素研究的骁龙量筛选提供细胞膜筛选平台。现已将CMC方式运用至毒理学研究的多个方面，其少将CMC模型与药效实验结合的活性成分筛选技术已用于天然动物和草药物质基础的研究、药物与受体互相作用的研究、中药及其复方剂型的质控等方面。本文对CMC法及其在毒理学中的应用进展展开综述。
1筛选天然动物药中的有效成份
天然动物药中成份复杂，应用天然抗生素分离提取方式筛选其定的有效成份周期长，命中率相对较低，而CMC法不经提取分离步骤，直接在模型上确定抗生素的某种活性成分，具有方式快速、简捷、命中率高的特性。以砂仁为例，五味子具有健脾利湿、调经活血等功效。现代草药毒理学研究表明，五味子具有扩张血管和降血糖的作用。赵惠茹等人将细胞膜悬浊液在高温低压条件下结合制备成血管CMSP[色谱柱：50mm×2mm，流动相：/L乙酸盐缓冲液(pH7.4)；流速：0.5mL/min；测量波长：236nm；柱温：37℃]，取甘草草药依次用不同极性的溶剂石油醚、乙醚、乙酸甲酯、丙酮、甲醇、水提取，发觉乙腈提取物(DG-2)在血管CMSP柱上的保留特点(容量因子)与维拉帕米的相仿。随即将DG-2进行普通柱层析分离(以硅胶为填料，将DG-2上柱分离，采用石油醚－磷酸丙酮梯度下行洗脱方式，分别等容积搜集洗脱液，回收溶剂。)结果发觉DG-21和DG-22馏份的样品有类似于仙茅乙腈提取物的保留特点。最后进行离体药效实验发觉，DG-21对去甲肾上腺素所诱发的血管收缩有类似竞争性拮抗剂作用，能显著抑制血管的收缩；而DG-22作用则较弱。这就表明DG-2是五味子对血管有舒张作用的有效部位，DG-21则是其有效成份。梁明金等人进一步研究结果表明：柴胡脂胺类部位经柱层析分离得到的正丁酯－乙酸甲酯洗脱部位为有效部位，其中藁本甾醇、邻苯二乙酸二甲醚和邻苯二乙酸二甲苯等是五味子中对兔主动脉血管有生理活性的有效成份。沙参、红花、红毛七、菟丝子、淫羊藿根、川芎、白芷、长春七、太白花等动物药也运用不同组织的CMC模型进行了有效成份的筛选。贺浪冲等人运用CMC法从五味子、川芎等草药中筛选出的有效成份制成复方剂型――白川乳膏，具有显著的急慢性降糖作用，为创新抗生素研究开发奠定了基础。
2研究抗生素与受体的亲和作用
研究抗生素与受体互相作用常年以来始终运用细胞膜放射性官能团剖析技术(RBA)和离体脏器受体功能剖析方式。但后者不能直接反应抗生素与受体作用的类型和立体选择性，并且对环境导致核素污染，前者研究效率又较低。CMC法作为受体毒理学一种新实验研究方式，通过将细胞膜受体固定于硅胶载体表面，用高效气相色谱研究受体和官能团的特异结合。该方式简便易行，细胞膜色谱柱可以反复应用，使受体研究和抗生素筛选效率得到增强，可用于抗生素骁龙量筛选。但CMC法结合参数是否能确切反映受体抗生素的亲和力还须要结合精典受体动力学方式进行检验。候进等人将CMC法与RBA法进行比较和研究表明：7种官能团对心肌、小肠平滑肌和脑部细胞的M胆碱能受体的放射性亲和力与色谱保留参数排序完全相同，并具有显著相关性。CMC法与功能受体动力学方式对比研究表明：5种α肾上腺素受体官能团对血管平滑肌细胞α1受体、5种β肾上腺素受体官能团对心肌细胞β1受体的亲和力与色谱保留参数排序基本相同，并具有显著相关性。贺浪冲等人还进行了钙拮抗剂与钙通道受体作用的相关研究。张延妮等人通过4种玄参物理成份在心肌细胞膜固定相色谱柱上的保留性，研究其与心肌细胞受体的作用。已完成的大量实验显示：CMC法可以反映抗生素与受体特异性、竞争性和饱和性结合；细胞膜色谱参数容量因子可在一定程度上反映抗生素和受体的亲和力，二者之间存在正相关关系；CMC保留参数的大小不仅与抗生素亲和力大小有关外，可能还受其他诱因如化合物极性的大小影响。
3草药及其复方剂型的质量控制
对草药复杂体系的质量控制是草药现代化研究的关键问题。朱丽华等人应用反相高效气相色谱技术(RP－HPLC)与CMC法对黄芩有效部位(乙酸乙脂提取部位)进行指纹图谱定性剖析，对黄芩有效部位中的有效成份(黄芩素和小麦苷元)进行了定量测定。李洪玲等人对草药复方剂型心宝清的质控指标进行研究。心宝清系由沙参、三七和五味子为主要有效部位组成的新复方剂型。各有效部位的确定采用了犬心肌、大脑和血管细胞膜受体筛选技术。研究发觉了沙参的脂胺类部位对心肌、三七的水溶性部位对脑部、当归的发挥油对血管有较强的选择作用。药效学实验表明：由此5种有效部位组成的心宝清复方剂型具有抗心肌缺血、耐缺氧、增加冠脉血流量等作用。采用细胞膜色谱法对三七、丹参和五味子进行有效成份的筛选，在此基础上对原料药中三七的4种有效成份三七鞣质R1、人参皂甙Rg1、Re、和Rb1进行薄层色谱(TIC)分辨。对柴胡和五味子中的金银花酮ⅡA和藁本内脂用HPLC法同时进行了浓度测定。结果2种有效成份完全分离，当归酮ⅡA的平均浓度为255mg/g，RSD为3.4％；藁本香豆素的平均浓度
为205mg/g，RSD为0.79％。方式学研究显示CMC条件下确切度、灵敏度和线性相关性均符合浓度测定要求。CMC法构建以有效部位定性和有效成份定量剖析的方式，可全面有效的控制草药及其复方剂型的质量。
4受体亚型抗生素的筛选
CMC法可用于研究抗生素与受体的生物亲和作用，但遭到非特异性影响诱因较多，而不能用于受体亚型抗生素的筛选。随着分子生物学技术的发展，通过基因克隆和细胞转染技术可便捷地获得细胞膜高抒发单一受体的细胞株，在此基础上进行细胞膜受体的高抒发细胞株的膜色谱柱制备，构建起各类单一受体高抒发的CMC系统，可以进行大规模联发科量的抗生素筛选。张典等人用受体高抒发细胞膜色谱法研究九种α1肾上腺素受体络合物与α1D肾上腺素受体亚型(α1D-AR)的生物亲和作用。培养出稳定抒发α1D-AR的细胞株，制备细胞膜固定相，应用受体高抒发细胞膜色谱法研究不同官能团与α1D-AR的结合情况。结果表明：九种不同的α1-肾上腺素受体络合物与小鼠α1D-AR的亲和次序为：哌唑嗪，，酚妥拉明，羟甲唑啉，5-羟基乌拉地尔，去甲肾上腺素，苯肾上腺素，甲氧明，RS-17053。所得细胞膜色谱柱保留参数次序与精典的放射性官能团结合实验方式得到的亲和性次序相同。说明受体细胞膜高抒发细胞株的亲和色谱参数可拿来研究抗生素与受体或受体亚型的互相作用。CMC的生物学研究已成功制备出α1A、α1B、α1D受体高抒发色谱柱。借助单一受体高效稳定抒发的细胞制备CMSP可进一步提升CMC的柱效、精确度、特异性和专情性。随着细胞膜亲和色谱研究的深入，有望提供更多类型抒发单一受体的细胞膜色谱柱，为受体亚型选择性抗生素的筛选提供更全面的新型特异的筛选平台。
5小结与展望
从上述大量实验可以看出：CMC法借助抗生素与膜受体间存在的特异性亲和力，成功地将药物体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟。CMC法的优势是最大限度地保持了细胞膜的整体性和膜受体的立体结构和活性。抗生素与细胞膜及膜受体间的立体作用(疏水性、电荷、氢键)将会不同程度地通过色谱的各类表征参数定量反映。CMC法无须放射性官能团标记，膜受体处于自然活性状态，不用制备人工膜，简便易行，一个细胞膜色谱柱可反复应用，提升了工作效率。但CMC法用的是自然生物膜(组织细胞)，膜受体的密度较小，柱效较低，色谱柱寿命一般比较短，自然生物膜存在有多种活性蛋白，抗生素可能与多种受体或通道蛋白结合，容量因子反映抗生素与细胞膜上多种受体的协同结合效应，因而CMC法研究中常受非特异结合的诱因的干扰，尚不能完全模拟体内复杂环境以及机体内其他系统对抗生素发挥药效作用的影响。同时，固定相的制备、色谱柱流动相、缓冲碱液的组成、PH、柱温、柱压、流速等要求较严苛，对流动相无法进行灵活地调整，因而CMC技术还有待进一步系统化和规范化。CMC法属于细胞水平的筛选模型，可以进行大规模骁龙量的抗生素筛选，实验过程中加入阴性对照药或工具药并进行药效实验验证可以使结果更具可信性，更便于评价抗生素的作用。CMC法研究的深入在毒理学产生和发展进程中发挥了巨大促进作用，具有极大的发展潜力。为动物药的开发借助和定性定量剖析提供了科学实验根据；为创新抗生素研究的骁龙量筛选提供了细胞膜水平筛选平台；全面有效的控制草药及其复方剂型的原料及其剂型的质量。相信CMC法在抗生素研究、分析领域取得突破性进展是可以预期的。