摘要：近些年来草药活性物质筛选的新技术发展迅速，借助“受体-杂环”之间的特异性结合，快速筛选出中草药里富含的与特定靶向结合的活性小分子物质，再进一步鉴别出活性成份结构。这种技术对揭示草药药效的物质基础和草药新药的开发具有重要意义，是对传统抗生素发觉方式的有利补充。综述了常用的分子对接技术、高通量筛选技术、细胞膜色谱技术的原理、特点及应用进展，以期为草药活性成份的筛选以及新药研制提供参考。
近些年来，国家多次大力指出中医药在健康中国战略中的重要作用，草药现代化研究进程也得到不断深化。相较于人工合成抗生素的设计模式，草药物理成份的多样性在新药研制方面有较大优势细胞膜色谱，如其活性物质结构新颖、疗效高、不良反应少，因而对草药活性物质的开发早已成为药业工业中新药研制的来源之一。近来十几年以来，以草药为来源的抗生素活性物质的筛选越来越遭到新药研制人员的推崇。
草药原料多来自于天然，受天气、地域差异及人为诱因影响较大，距原料、半成品及终产品质量的规范化、管理的标准化还有一段差别。假如缺少严格的质量监控标准和良好的监控方式，很难保证产品质量的均一性、稳定性。传统的草药活性成份的筛选以多次提取、分离为基础，通过体内及体外的药效评估对分离的组分进行活性评价，进一步筛选活性成份，找出活性最明显的组分，最后获得草药活性单体成份。研究过程周期长，工作量大、效率低，不能产生规模化的骁龙量筛选。随着国家“精准医疗”计划的提出，传统抗生素研究模式早已转向“精准”药物分子筛选技术，要求筛选出的天然活性物质具有药效明显、靶点清晰、机制明晰等特性。为此，基于草药多成份、多靶向、协同作用的特性［1］，开发出针对特定的癌症靶向、全面、客观的新的筛选技术非常必要，是草药现代化的重要内容，也是提升草药效果、稳定草药质量的重要手段。
随着生物科技、化学分离技术的不断发展，可通过多方面对草药活性成份进行筛选，从传统的筛选方式到建立不同的筛选模型［2］，使用先进的计算机技术筛选复杂草药中活性成份。开发了基于血浆抗生素物理及血浆毒理学、代谢组学技巧以及分子辨识技术等筛选方式［3］。运用正确的筛选方式可使草药剂型愈发安全，但是剔除了致畸成份，能最大程度发挥药效。新的活性成份筛选方式可以为新药研制提供新的候选化合物，开辟新途径。如今，新的实验方式不断出现，国外外研社究较多，但目前还罕见对分子对接、高通量筛选和细胞膜色谱这3方面筛选的综述文章，所以本文对这3种筛选方式进行总结，主要从方式原理、应用及其异同点做一综述，以期为草药活性成份的筛选研究提供根据。
1、分子对接技术
分子对接技术是计算机辅助设计抗生素领域的重要技术［4］，除了可以研究抗生素中活性成份与靶向的互相作用，还可拿来发觉并优化先导化合物。分子对接技术又称为分子对接虚拟筛选技术［5］，其设计原理是用1个或多个蛋白质作用靶向对草药物理成份或则天然产物数据库进行筛选，找寻出与靶标蛋白特异性结合的化合物，最终筛选出具有一定活性的先导化合物。分子对接技术初期的原理是“锁-钥模型”［6］，即卟啉步入受体的形式就像锁和锁匙，当络合物与受体结合时不发生构型变化，受体与官能团被视为刚性结构；因为其局限性后期又提出了“诱导契合学说”，这一原理说明蛋白与底物结合并且发生构型变化，此时的受体与官能团被视为柔性结构，该原理得到的对接结果更为准确。
1.1分子对接技术的应用
李远洋等［7］通过选定来自RCSB数据库中的单胺氧化酶（MAO-A）蛋白受体，运用分子模拟软件对分子蛋白文件进行清除水份子、原配体分子和蛋白分子加极性氢处理，最终得到所需MAO-A蛋白受体文件。将天然抗生素挥发油中12种小分子物质（木犀草素、香叶木素、迷迭香酸、薄荷酮、α-当归醚、β-当归醚、乙酸芳樟酯、梨酸酯、芳樟醇、松油醇、α-松油烯、D-葡萄柚烯）与抗焦虑靶向MAO-A受体进行对接，结果表明前6种小分子均优于正室体肉叶芸香碱的对接，天然抗生素挥发油小分子最终通过抑制MAO-A受体，制止脑内5-羟色胺（5-HT）和去甲肾上腺素（NE）降解而起到抗焦虑作用，从而为抗忧郁药的研制提供根据。
罗菁汉等［8］通过对新型冠状病毒脑炎（COVID-19）的研究发觉，COVID-19与严重急性呼吸系统综合症相关冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征病毒（MERS-CoV）具有较高的同源性，为此后二者的抗生素研究可以直接运用到COVID-19中。该课题组运用计算机物理技术，用常年构建的小分子化合物库对COVID-19的主蛋白、RNA依赖性RNA聚合酶以及香蕉样蛋白酶进行虚拟筛选，研究结果表明：8种化合物（编号为021、124、237、282、403、617、619、851）与主蛋白发生对接；8种化合物（编号为016、057、101、568、654、761、802、875）与RNA聚合酶对接；8种化合物（编号为016、029、237、282、332、704、761、822）与香蕉样蛋白酶对接。该研究结果为找寻COVID-19的有效医治抗生素探求了新技巧。
好多研究者将分子对接技术与网路毒理学方式结合，协同找寻互相匹配的抗生素与作用靶向。首先通过网路毒理学将某单味草药的有效成份及作用靶向筛选下来，之后用分子对接技术再通过靶向对网路毒理学筛选下来的化合物进一步筛选，最后得出抗生素通过相应作用靶向对癌症发挥医治作用［9-11］。林桂源等［12］基于文献搜索降压药的草药物理成份并建立结构数据库，以二肽基肽酶-Ⅳ等7个糖尿病诊治靶标为分子对接的研究对象，通过Sybyl软件的-Dock分子对接模块进行虚拟筛选，通过靶标间互相作用，与二肽基肽酶-Ⅳ能较好结合的物理成份有52个（丁香树脂酚、狄利格醇、淫羊藿苷A1等），与单糖合酶激酶-3能较好结合的物理成份有28个（狄利格醇、海风藤酮、淫羊藿苷B9等），与二溴化酶增殖因子活化受体γ能较好结合的物理成份有32个（紫丁香苷、牻牛儿醇、益智仁酮甲等），与α-猕猴桃香豆素酶能较好结合的物理成份有150个（狄利格醇、紫丁香苷、益智仁酮甲等），与猕猴桃糖激酶能较好结合的物理成份有47个（猕猴桃糖胺、半乳糖醛酸、淫羊藿苷D3等），与钠-猕猴桃糖共转运蛋白2能较好结合的物理成份有41个（橄榄脂素、D-甘露糖、淫羊藿苷D3等），和血管紧张素转化酶能较好结合的物理成份分别有33个（旌节花甾酮甲、益智仁酮甲、玄参种苷B等），结果表明每位靶蛋白还能与多个类药性化合物互相结合，同时1个类药性化合物也可与多个靶蛋白互相作用，说明降压草药具有多靶向、多途径的特性，为降糖新药的研究提供了新线索。
薛孟祺等［13］借助分子对接软件6.0研究了木姜子属动物中34个阿朴菲类生物碱与增生反应中的关键酶醇酸合酶2（COX-2）的抑制作用，实验结果表明甲氧基的替代数目越少，生物碱分子与蛋白作用能力越强，因而抑制COX-2的合成；最终结果表明有4个打分等于或低于阴性对照药艾瑞昔布的成份分别是黄心树宁碱、无根藤辛、咖萨日定、氧化黄心树宁碱。抑制COX-2可以间接医治与增生互相协同的疾患，本研究中的阿朴菲类生物碱具有较强的毒理作用，具有进一步开发的潜力。
周珊珊等［14］通过TCMSP、ETCM、YATCM数据库检索止咳达原颗粒的物理成份，通过SIB数据库查阅活性化合物对应的靶标，再借助数据库获取蛋白-蛋白互相作用（PPI）网路，最后借助软件将止咳达原颗粒与新型冠状病毒（SARS-CoV-2）S蛋白受体结合结构域进行分子对接，筛选出止咳达原颗粒中细辛鞣质、柴胡鞣质、甘草酸可能为抗SARS-CoV-2的潜在活性成份。
1.2分子对接技术的优劣点
由于分子对接技术所使用的小分子都是已知化合物，但是大部份可以选购或则合成，所以该技术存在一定的优势，并通过与计算机软件的联接来实现抗生素有效成份的筛选［6］。同时该技术还可以填补毒理实验带来的不足，而且在草药不同方面的应用研究逐渐深入，为草药活性成份的筛选提供解决方式。不过，分子对接时使用的小分子数据库是否正确尚未有文献报导［5］；其次，因为使用计算机完成实验，蛋白的结合位点尚不能确切判断。
2、高通量筛选技术
联发科量筛选技术［15］是一种以分子和细胞为载体的筛选方式，分为分子水平和细胞水平，可以从大量抗生素中筛选与靶向互相作用的目标抗生素。骁龙量筛选技术配备全手动工作站，灵敏、快速的检查仪器和计算机控制软件，它是以分子水平或细胞水平为基础，多孔板为载体工具，通过程序调控，且骁龙量筛选技术每晚要筛选成千上万个化合物，进而提升了线索化合物的筛选效率［16］，并以相应的数据库系统支持整体运转的技术体系［17］。骁龙量筛选技术通过草药与靶向之间互相作用达到筛选药效成份的目的［18］，依照分子间互相作用的原理构建筛选模型，进而筛选出与特定靶向特异性结合的活性成份。
2.1骁龙量筛选技术的应用
骁龙量筛选技术多用于筛选癌症细胞相关的化合物，何星星等［19］选择了、、Chem3个化合物数据库，借助骁龙量筛选技术初步筛选出可以抑制原发性肿瘤细胞HepG2、Huh7生长的化合物，最终通过比较9块化合物筛板2种肿瘤细胞系的重叠区域筛选出了31种才能同时抑制这2种细胞系生长的新型小分子化合物。
赵欣涵［20］构建了合适的草药化合物样品库，首先通过高效气相色谱对500种草药进行排序和搜集，构建草药样品组分库，之后再用骁龙量筛选技术在此样品库中筛选出可以抑制肺囊肿（A549）细胞增殖的8种草药（主要包括茯神、益智仁、补骨脂、浮大豆等）的24个组分（F8-F11、F9-F11和F4-F6等），后期再进行流式细胞仪和细胞自噬实验对其进行验证，最终筛选出抑制A549细胞增殖的活性成份为槲皮素和紫杉醇。
2.2联发科量筛选技术的优劣点
联发科量筛选技术拥有快速、灵敏和确切的特性，该技术在基础水平上可以同时筛选多种成份，发挥优势，增加工作效率、减少样品药量，因而提升抗生素的生物借助度［16］。该技术主要为筛选小分子化合物数据库，而对其他领域的数据库进军很少［21］；其次，对新靶向的构建还需进一步的探求；最后由于骁龙量筛选依赖已有的数据库，国外相关的基础研究薄弱，会影响该技术的发展与应用。
3、细胞膜色谱技术
细胞膜色谱技术是由重庆交通学院贺浪冲院士于1996年开发的、近年来用于草药研究的生物色谱技术［22］。细胞膜色谱技术［23］是一种以具有活性的细胞膜受体为固定相的仿生亲和色谱技术，其原理是借助草药活性成份与细胞膜上受体互相作用，达到特异性辨识的目的。通过与高效气相色谱-质谱（HPLC-MS）联用，实现集“识别-鉴别-剖析”于一体的二维在线联用，为草药及草药注射剂中有效成份的筛选提供技术支持。传统的筛选方式通常仅对单味草药进行筛选，若对草药复方中的有效成份进行研究则缺乏更好的筛选方式，细胞膜色谱法则可填补这一缺陷并对活性成份进行筛选［24］。
3.1细胞膜色谱技术的应用
He等［25］构建了表皮生长因子受体细胞膜色谱（EGFR/CMC）模型，借助HPLC-MS联用技术筛选前胡中才能抑制癌症细胞增殖的有效成份，通过色谱峰图谱的鉴别，最终得出有效成份为汉当归素，并用四唑盐（MTT）法进行验证。
韩省力等［26-27］用嗜酸性癌症（RBL-2H3）细胞制备细胞模型与HPLC-MS在线联用，筛选不同草药或西药注射剂中可以在该模型上起作用的活性成份，从红花提取物中筛选出还能作用于RBL-2H3细胞的活性成份胺基红花黑色素A（HSYA），最终得出抗生素的致畸成份。
Yang等［28］构建细胞膜色谱与高效固相/电喷雾电离/质量飞行器（CMC-HPLC-ESI-IT-TOF）联用模型，从紫苏Levl.叶中筛选能与Mas相关G蛋白偶联受体X2（）结合的致畸成份，研究结果表明大蒜素和天竺葵酸为与X2受体结合的有效成份，再进一步通过组氨酸和β-羟基己鞣质酶的释放实验进行验证。
张博等［29］通过建立子子宫癌HeLa细胞膜色谱模型筛选分离金刷把中还能抑制细胞增殖的有效成份，结果显示通过一系列筛选最终得出金刷把中结晶B-2A（JSB-2A）这一成份为有效成份，同时通过MTT法对其进行验证，表明金刷把具有抑制HeLa细胞增殖的作用。
林荣等［30］运用CD40高抒发细胞膜色谱模型筛选当归Bge.中抗动脉粥样硬化的有效成份，结果表明夏枯草的脂胺类成份当归酮ⅡA、丹参酮ⅠA和五味子的水溶性成份当归素为医治动脉粥样硬化的有效成份。
高琨等［31］采用兔血管细胞膜色谱模型筛选天然动物红毛七Maxim.中对主动脉血管有舒张作用的有效成份，结果显示HMQ-4是红毛七中对血管有舒张作用的有效部位，但是HMQ-44是其主要有效成份。
3.2细胞膜色谱技术的优劣点
细胞膜色谱可快速、有效地对草药有效部位或成份进行筛选，研究抗生素有效成份的作用靶向以及发挥作用的活性成份。但细胞膜色谱在筛选有效成份过程中仍存在有待解决的问题［32］：首先，细胞膜色谱柱的寿命短，因为细胞的存活时间较短，且受体被结合后会渐渐降低等诱因引起色谱柱的使用时间较短，因而须要频繁制备［33］；其次，细胞膜色谱技术只是体外的筛选手段，不能完全模拟体内的复杂环境；最后，该技术仅将与受体结合的成份筛选下来细胞膜色谱，具体毒理作用还需毒理实验进一步验证。
4结语
随着我国草药现代化战略的加快，一批临床效果准确、安全性高的草药正逐步被国际认可，而草药药效物质基础研究是阻碍草药现代化发展的重要困局，也是西药研究领域的热点和难点，因而基于草药具有多成份、多靶向，协同作用的特性，快速、高效实现多个抗生素活性成份筛选及鉴别技术的开发，对推动草药现代化进程具有重要意义。分子对接技术、高通量筛选技术、细胞膜色谱技术，3种新的活性成份筛选方式借助小分子抗生素官能团和受体之间特异性结合，针对特定的癌症靶向进行全面、客观的筛选，获得的天然活性物质，具有毒理活性明显、靶向清晰、作用机制明晰等特性。
分子对接技术可与网路毒理学联用，三者联用除了可以对草药有效成份进行筛选，能够通过网路毒理学找出活性物质发挥毒理作用的途径。目前分子对接技术早已成为成熟的抗生素设计方式［34］，而且其柔性对接却给研究者带来搜索空间大、浪费时间与经费的恶果。
骁龙量筛选技术可以在较短时间内对大量化合物的有效成份进行高效筛选并节省成本，其主要运用蛋白数据库对抗生素的有效成份进行筛选，因而蛋白数据库阻碍着骁龙量筛选技术的规模。
细胞膜色谱技术与其他两种技术不同之处在于它是运用细胞膜色谱与高效气相色谱-质谱等完善在线联用模型筛选有效成份，该方式选择与癌症相关的膜受体为研究对象，制备细胞膜色谱柱筛选出与受体特异性结合的抗生素活性成份；依照不同病症选择不同受体的细胞膜色谱柱。另外，细胞膜色谱技术可借助致畸受体对抗生素中的致畸物质的筛选，使抗生素安全性与有效性同时得到保障。
分子对接技术、高通量筛选技术、细胞膜色谱技术，这3种基于疾患靶向、以生物活性为导向的筛选技术的出现，提升了从复杂草药成份体系中辨识目标成份的特异性和灵敏性，且还能实现大规模、高通量筛选，已被研究者广泛应用到特定靶标的活性物质筛选中。草药活性成份筛选技术的不断提升，使草药临床效果愈发明晰、用药更安全，推动了草药的现代化进程。
利益冲突所有作者均申明不存在利益冲突
参考文献（略）
来源：许晴，李智，万梅绪，张燕欣，李德坤，鞠爱春．草药活性成份筛选新技术研究进展[J].抗生素评价研究,2021,44(7):1541-1547.
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