目的研究分离、培养大鼠骨髓血管内皮祖细胞的方式并对其进行诱导分化鉴别，为临床进行缺血性疾患的取代医治奠定细胞学基础。方式用灌注法分离大鼠骨髓血管内皮祖细胞，用血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子诱导其分化，形态学观察细胞的生长过程，并借助抗CD34抗原鉴别血管内皮祖细胞，借助抗vWF抗原、抗eNOS抗原鉴别血管内皮细胞。结果大鼠骨髓血管内皮祖细胞可在体外培养条件下贴壁生长，可诱导分化为抒发特异性组织蛋白的内皮细胞。推论在大鼠骨髓内可分离出骨髓源性血管内皮祖细胞，呈贴壁增殖状态，并有分化能力。
血管内皮祖细胞;血管内皮细胞;骨髓源性;分化
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骨髓中的血管内皮祖细胞(，EPCs)可以穿行到外伤组织出席新血管产生，并能分化为内皮细胞(，ECs)，促使局部血管生成和血管新生。目前已有研究者将EPCs用于医治缺血性疾患，并取得了良好的医治疗效，具有再生和分化能力的EPCs已渐渐成为医治血管系统疾患的理想细胞材料〔1〕。而且，目前EPCs主要通过外周血进行提取，这些方式获取的细胞数目较少，而骨髓来源的EPCs研究报导不多。本研究从BALB/c大鼠分离骨髓源性EPCs，在体外进行培养扩增，诱导其分化细胞膜色谱，构建一套完整的骨髓源性EPCs的分离、培养、诱导分化和鉴别的方式，为其作为细胞材料医治血管外伤方面提供根据。
1材料与技巧
1.1实验材料BALB/c大鼠，6～8w龄，雄雌不限，由四川学院医学部基础实验植物部提供，SPF级;DMEM/F12(1∶1)培养基、胎牛血浆由Gibco公司提供;内皮细胞生长因子(r，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(，bFGF)由Sigma公司提供;纤维联接蛋白(FN)由上海鼎国公司提供;抗CD34抗原、抗vWF抗原、抗eNOS、SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒由博士德公司提供;6孔一次性培养板、10cm一次性培养皿由Costa公司提供。
1.2EPCs的分离与培养〔2〕BALB/c大鼠断颈处决后，放在75%酒精曝晒杀菌5min。无菌条件下分离胫骨，除去胸肌组织，用1ml注射器汲取1ml无血浆DMEM/F12培养基，从肱骨一端进针进行冲洗，反复3次，充分冲出骨髓组织，用200目碳钢筛网进行碾压，分离成单个细胞。用无血浆DMEM/F12离心，弃碱液，2ml无血浆培养液重悬细胞加入到淋巴细胞分离液上离心，1500r/min，30min。用吸管吸出中间黑色云雾状细胞带，培养液漂洗2次。用DMEM/F12培养液(为基础培养基细胞膜色谱，bFGF和VEGF终含量均为10ng/ml)调节细胞终含量为5×105/ml，接种到预铺有纤连蛋白10cm培养皿，37℃、5%CO2培养箱中进行培养，每3天换液1次。
1.3EPCs的诱导分化鉴别〔3〕将培养细胞接种于预先置有盖玻片(多聚赖谷氨酸处理过)的6孔培养板中进行培养，并加入含bFGF和VEGF的DMEM/F12培养基进行诱导分化，于
4、20d后分别用乙醇固定，进行免疫细胞物理染色观察EPCs的分化。具体步骤如下：3%H2O2水孵育5～10min，以清除内源性胺基化物酶活性;滴加封闭用正常绵羊血浆工作液，温度孵育10～15min，倾去，勿洗;滴加1∶100的一抗37℃孵育3h，PBS冲洗(3min×3次);滴加兔抗小鼠二抗，37℃孵育10min，PBS洗(3min×3次);滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育10min，PBS冲洗(3min×3次)。DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗,脱水,透明,中性树脂封片并镜检。
2结果
2.1骨髓源性EPCs的培养从骨髓分离的细胞接种于培养基后，约2d开始贴壁，呈梭样或三角形样下降，4d后细胞生长速率开始增快，约10d开始出现集落样生长状态，有梭形细胞从集落伸开，相互联接成片(图1)，约18～20d细胞相互融合，呈铺路石样状态。
2.2EPCs及ECs的细胞免疫物理鉴别未加VEGF和bFGF的EPCs免疫物理染色显示CD34阴性反应,培养的部份细胞表面上带有均匀的黑色颗粒(图2A)。培养10d经VEGF和bFGF诱导后，部份细胞vWF和eNOS染色均呈阴性(图2B，图2C)。
3讨论
当前，和老龄化密切相关的动脉粥样硬化、脑缺血、心肌缺血、脑梗塞和心肌梗塞等病症发病率日渐增高。研究发觉，在这种病症的恢复过程中，高龄老化导致机体血管发育能力障碍，血管生长因子合成降低，血管内皮细胞功能异常，对细胞因子的反应力也上涨。目前已有植物实验研究移植EPCs医治动脉粥样硬化和脑梗塞，降低内皮细胞在这种病症血液循环中的动员及增殖，结果表明内皮祖细胞对根治这两种癌症有着积极的作用〔4～6〕。
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