【摘要】：目的：本课题是以β1肾上腺素受体(β1-AR)作为抗生素筛选的靶向,通过构建高抒发β1,-AR/CMC模型,并与UPLC/MS进行联用,筛选、鉴定出桑寄生中作用于β1-AR的活性成份；通过测定活性化合物对cAMP及PKA的抑制作用,筛选高选择性β1-AR抑制剂,并考察其抗细胞自噬的作用。课题所构建的剖析方式,为快速有效筛选草药作用于β1-AR的活性成份开辟新途径,对草药创新抗生素的研究与开发具有极其重要的意义。方式：首先,本课题采用免疫印迹及流式细胞技术测量β1-AR抒发；其次,将细胞膜结合到硅胶表面,制备高抒发的β1-AR细胞膜固定相,考察固定相色谱特点及稳定性,构建细胞膜色谱(CMC)模型；再度,完善β1AR/CMC--UPLC/MS剖析方式细胞膜色谱,考察色谱系统的特异性和可靠性,并筛选、鉴定桑寄生中作用于β1-AR的活性成份；最后,测定了桑寄生中活性化合物对β1-AR的相关下游讯号因子cAMP及PKA抒发水平的影响,考察活性化合物对β1-AR的抑制作用,因而筛选高选择性的β1-AR抑制剂,同时细胞膜色谱,检查其抗细胞自噬作用。结果：本文成功建立β1-AR/pEGFP-N1喂奶植物抒发引物,并通过脂类体转染至CHO-S细胞,经G418筛选和流式细胞仪分选后获得的β1-AR/CHO-S细胞具有显著的红色萤光,且经激光共聚焦显微镜分层扫描可见,β1-AR蛋白抒发定位在细胞膜上；转染的β1-AR/CHO-S细胞能得到80KD左右的融合蛋白带,分子量大小与目的蛋白一致；同时流式细胞法测量结果显示,经多次筛选得到的β1-AR/CHO-S细胞,其阴性率为96.31%±8.7%。
采用高抒发β1-AR/CHO-S细胞制备CMC柱的固定相,构建β1AR/CMC--UPLC/MS剖析方式。采用美托洛尔和异丙肾上腺素作为阴性对照考察β1-AR/CMC色谱特点,结果表明抗生素分子与膜蛋白β1-AR的才能互相作用,具有生物亲合色谱特点,但是经流动相的磨蚀,用本文方式制备的β1-AR/CMSP上的细胞膜仍能均匀分布,不易流失。采用尼群地平(NT)和美托洛尔(METO)的混和标准碱液考察β1AR/CMC--UPLC/MS方式的辨识、分离和鉴别能力,在β1AR/CMC模型上与细胞膜受体互相作用的组分可以选择性地保留出来,而无作用的杂质成份则被直接排出色谱柱,相应保留组分的结构可以由UPLC/MS进行鉴别。本文采用p,AR/CMC--UPLC/MS剖析方式筛选草药桑寄生提取物中作用于β1-AR的活性成份,经鉴别,保留的主要组分通过UPLC/MS鉴别为异欧黄芩素。竞争实验结果表明,异欧黄芩素与美托洛尔竞争结合细胞膜受体,说明其在细胞膜上的结合位点有部份重叠。体外毒理实验证明,与对照组相比,异欧黄芩素和美托洛尔对cAMP及PKA均具有抑制作用(P0.01),并能抑制由ISO导致的细胞自噬。推论：我们构建了β1AR/CMC--UPLC/MS的剖析方式,可用于筛选草药等复杂体系中作用于p1-AR的活性成份。β1-AR/CMC模型还能增强靶点受体抗生素筛选的有效性和特异性,为有效筛选草药作用于β1-AR的活性成份提供新的技术手段,对草药创新抗生素的研究与开发具有极其重要的意义。
