摘要
初期的“T细胞活化”事件是在质膜的脂类微环境中启动的。脂类膜次序的作用(L)o)在时空讯号中，T细胞中的抗体受体被定位，但仍不清楚。我们研究了膜序(L)的作用。o)/衰弱(Ld)抗体特异性CD4+T细胞的激活和克隆的扩增首先导致膜衰弱，之后通过将固醇插入衰弱的质膜中来重建膜序。抗体特异性CD4的显着恢复+用尿酸重建破坏的膜序后，观察T细胞的增殖反应。那些重建实验证明了Koch的假定，证明了尿酸依赖的膜序(L)o)对于CD4所形成的反应是至关重要的。+并强调T细胞膜有序性和脂类微环境在T细胞膜抗体受体讯号传递中的重要性。
序言
用克隆型CD4检查外源抗体+T淋巴细胞通过其抗体受体，讯号转导通过多个抗体受体相关讯号分子发生在质膜的脂类微环境中。,,。据悉，协同剌激蛋白CD28和其他辅助性/黏附蛋白启动许多蛋白酪谷氨酸激酶(如p56)驱动的讯号通路/网路。莱克)，适配器蛋白(LAT)，小GTP结合蛋白,,。那些在质膜上启动的讯号风波激活了三种转录因子NFκBnft和api，它们对推动CD4的存活、克隆扩充和分化至关重要。+T细胞,,。尽管乙酸化风波的时间序列和T细胞内的多种讯号通路/网路仍然是研究的焦点，但脂类微环境和血脂依赖的膜序在CD4质膜讯号蛋白的空间组织中的作用仍然是研究的焦点。+T细胞及其在检查外源抗体后的克隆扩增尚不清楚。
质膜的组成赋于了它化学性质。用饱和/不饱和脂和固醇(Guv)或从细胞膜(Gpv)衍生的合成/模型膜的实验，为了解其组成磷脂的缔合行为提供了看法。,,,,,,。不饱和和饱和磷脂在视觉上分离成无序(L)。d)和有序(L)o)阶段，分别,,,,,,。但是，在维持在37°C的不对称生物膜中，这类结构域的功能意义仍旧存在争议。,,,。近来的报导显示抗体受体均匀地分布在天真T细胞的质膜上，但是单体tcrαβ与mhc肽复合物结合。表明它们被排除在纳米级脂类结构域之外。与此相一致的是初期T细胞讯号风波发生在脂类纳米结构域之外的数据。。相反，我们觉得细胞膜呈现出小的动态纳米级有序结构。,,,,,。当有序结构域中的蛋白质/分子被交联以形成中尺度的脂筏时，小的动态脂筏被稳定出来。,,,,,。据悉，CD4之间的直接互相作用+T细胞与抗体提呈细胞推动有序结构域的结合。提议的T细胞活化模型须要考虑膜脂微环境的作用，非常是尿酸在L的产生中的作用。o和Ld膜上的结构域。饱和磷脂的缔合行为很可能促使真核细胞质膜中有序结构域的产生，如同模型/诱导膜中所报导的那样。,,,,,,.
我们研究了尿酸依赖的膜序在原发性CD4抗体特异性应答中的作用。+T细胞CD4抗体特异性反应+T细胞先用7-酮固醇增加其膜序，之后通过插入分级的固醇来重建固醇依赖的膜序。Di-4-是一种极性敏感的萤光颜料，用于膜的波谱成像，并在每位细胞的基础上用流式细胞仪定量膜序。亲脂萤光探针插入外膜，检查到膜水化后脂类堆积。我们展示了抗体特异性CD4的复活。+T细胞克隆扩增后，重建固醇依赖的膜序。
方式
大鼠
4~8周龄αβ转基因用于这儿报导的实验。按照机构植物保护和使用委员会(IACUC)批准的合同，大鼠被安置在维拉诺瓦体内并饲养。在本原稿中提出的在实验研究中使用大鼠的伦理认可得到了维拉诺瓦学院IACUC的批准。
细胞制备和细胞培养
将DO11大鼠的淋巴结(外周、腋下、下颌)细胞用玻璃切块蒸熟后制成单细胞悬液。提取细胞通过100m筛(BD生物科学，圣路易斯，CA，日本)过滤，再漂浮在RPMI1640-含5%FBS(Sigma，MO，USA)和2毫米HEPES缓冲液(Sigma，MO，USA)中。细胞计数，1000rpm离心10min，4°C离心10min，终含量为1×10时，再漂浮细胞颗粒。6在含10%FBS、2mm非必需多肽、50IU/ml抗生素和50μg/ml抗生素、1μg/ml漏斗酮、2mmHEPES(-，Grand，NY)的RPMI1640培养基中细胞/ml。
7-酮尿酸和尿酸在质膜中的插入
为了形成膜衰弱，从DO11TCR转基因大鼠中分离出淋巴结细胞，离心后再漂浮于Opti-MEM培养基(-Life，Grand，NY)1×10。6与7-酮固醇(7-kc)酰基-β-环寡糖(Mβcd)(Sigma，MO，日本)复合物在温度下孵育10分钟前的含量(如前所述)。分别在70M、35M和17.5M氨水中与水溶性的0.3mmββCD混和，得到7-KC和M-KC-CD配合物。尿酸-M-βCD配合物的生成也是类似的.MβCD推动了(和血脂)插入质膜。,。在Opti-MEM中与7-KC-MβCD(和尿酸-MβCD)复合物孵育，以降低血浆尿酸的曝露.为恢复细胞膜的有序性，加入固醇(35M&17.5μM)MβCD(0.3mm)(Sigma，MO，USA)复合物，加入7-KC-MβCD复合物后，在温度下孵育10min。
流式细胞仪对膜序与膜衰弱的评价
淋巴结细胞用0.5M(终含量)的Di-4-和抗CD90.2-AlexaFluor-647在温度下孵育20min(-Life，Grand，NY，USA)。。T细胞计数采用抗CD90.2--647结合物(日本加利福尼亚州，).用流式细胞仪(BD生物科学，加拿大温哥华州东卢瑟福)对枚举T细胞的细胞膜进行偏振光区分检测。。在温度下(~69°F)用Di-4-和抗CD90.2--647标记后，用等渗0.1MPBS清洗探针。与膜中磷脂平行排列的膜颜料di-4-，在488nm激光迸发下，可以对质膜进行偏振光区分成像，获得较高的膜流动性或无序性(L)。d)在630nm处，缩聚或膜序(L)o)在570nm处,,,,。在温度下(~69°F)，在FL2(570Nm)和FL3(630Nm)通道中捕获了Di4-萤光团的幅射。
经适当的补偿后，在的FL4通道上捕捉到在670波长范围内的AlexaFluor-647在CD90.2阴性细胞上的发射。未处理淋巴结细胞“不医治组”为阳性对照，用0.3mmMβCD处理的细胞为载体负荷对照。为了量化膜次序/流动性的改变，我们使用了早先公布的公式的修正版本来估算相对(R)gp值，以评估di-4-标记的免疫细胞的整体膜序/衰弱。。简单地说，GP值是通过在570nm和630nm处表示Di-4-萤光发射的归一化比值来估算的，分别反映了膜的整体有序性和无序性。流式细胞术是依照原先公布的设置设置的。。每位样本(10,000个细胞)估算GP，其中大多数为门控队列。而曾经的报导使用双光子显微镜数据来评估在用di-4-标记质膜后的脂类堆积情况。，我们用流式细胞术进行定量剖析是在单细胞基础上进行的。
$RGP={{Text{~}frac{{MFI_{570}-{Text{{630}{MFI_{570}}+{Text{{630}$
RGP=比值广义极化，MFI=平均萤光硬度。
DI-4-染色细胞共聚焦显微镜下的活细胞显像
为了排除颜料共焦成像内部化的可能性，我们根据已公布的合同进行了染色共焦成像。。αβ转基因大鼠淋巴结T细胞(1×10)6/ml含量)在Opti-MEM无血浆培养基中被准许结合多聚-L-赖谷氨酸镀层玻璃玻片(日本PA电子显微镜学)在4°C下曝晒60min，在温度下在汉克斯平衡盐氨水(HBSS)(热费舍尔，MA)中浸洗过多的细胞，同时使幻kt板重新适应环境湿度。贴于玻片上的细胞用35μM7KC(50μl)处理或未处理10min。在温度或4°C下，用5μMdi-在HBSS中浸洗玻片20min或4°C，除去超过7KC的现象。L用4%多聚甲醛(PCHO)乙酸盐缓冲液(PA，日本)在温度下固定5min，用Di-染色。过量的di-颜料是通过在安装步骤前倾斜幻kt板来消除的。染色细胞用含DAPI的10μ1安装培养基(乌克兰加利福尼亚州矢量实验室)覆盖，之后用玻璃玻片覆盖。采用LeicaTCSSP8倒置共聚焦萤光显微镜，在630×全放大率下，用标准和HYD共聚焦萤光显微镜对细胞进行成像，并进行序贯扫描。原本描述的共焦设备设置，以及下边描述的小变化，用于图象采集。。用408nm(DAPI)和488nm(Di-4-)激光照射样品.用标准PMT检查DAPI，波长410~460nm。用两种采集Di-4-，第一次测量波长范围为500~540nm(有序相)。第二种HDPMT在640~750nm范围内搜集波长(无序相)。图象大小为512×512象素，针眼调整为1个Airy单元。扫描速率为400Hz，直线平均设置为4。HyD2(有序)和HyD3(无序)的增益设置为中等水平。对焦设置为1，有序相位为伪色红色，无序相为伪色蓝色。
MTT法评价T细胞增殖
抗体特异性克隆扩增/CD4应答+用MTT剖析试剂盒对T细胞进行检查(公司，麦迪逊，WI，日本)。未经医治或0.3mmMβCD医治的CD4抗体特异性克隆扩增+细胞，7-KC和/或尿酸处理的CD4+T细胞在剌激肽c-ova存在的情况下，被检测其克隆扩张的可能性。323–339(测试)和c-–334(对照)肽(Sigma-，，Tx)由同基因抗体提呈细胞抒发。将MTT(3-(4，5-二硝基咪唑-2-基)-2，5-二硝基四氮唑溴)试剂(20l)加入96效价板中培养4h，用分光光度计在490nm处测定光密度。.
统计剖析
Anova剖析与Tuke-后测剖析在所有实验中均有显着性差别.Anova剖析致力找出各组均值之间的差别，而Tukey-后测剖析则量化了这种差别。当p值
道德认可和参与的同意
在本原稿中提出的实验研究中，大鼠的使用得到了维拉诺瓦学院植物保护和使用机构委员会(IACUC)的批准。本研究中使用的所有方式都是按照强制性的机构、州和联邦细则和准则进行的。据悉，这项研究是根据与“抵达准则”一致的准则进行的().
结果
尿酸在7-Kc诱导的衰弱细胞中恢复质膜秩序
7-kc，一种文蛤，当被传送到CD4膜时+T细胞在不影响T细胞活力的情况下改变细胞膜次序及其对外来抗体的增殖能力。通过插入尿酸重建膜次序后，T细胞中抗体特异性应答的恢复尚未被测量.为了研究和量化尿酸依赖的平衡从无序阶段到更有序阶段的转变，我们首先开发了一个实验系统，以控制cd4质膜的破坏和膜秩序的重建。+T淋巴细胞。先用7-KC(70μm，35μm，17.5M)处理淋巴结细胞细胞膜抗原，之后用不同含量的固醇(35μm，17.5M)进行重组，或未重组。固醇及其衍生物，因为其两亲性，不能直接插入质膜，因而与水溶性MβCD络合膜传递。,。MβCD在低含量下不会改变活化(补充图)。(A)CD4抗体特异性增殖+T细胞(附图)b)。为评价T细胞的膜功能衰弱，采用647抗大鼠CD90.2和萤光Di-4-染色，分别与MβCD(0.3mm)或7-KC(70M-17.5M)-MβCD复合物在温度下孵育10min。为了确保Di-4-萤光颜料与膜结合，并在我们一般在温度下进行的流式细胞术实验年报告膜次序/衰弱，我们用共聚焦显微镜对染色细胞进行了观察。作为对照组，我们用Di-4-在4°C染色，这些气温可以避免细胞内吞。补充图说明大部份颜料与质膜结合。据悉，我们没有观察到大量内在化的证据(图)。S，面板B&C对N&O)或7-KC的存在(如图所示)。S，面板F&G对R&S)。
流式细胞术实验中，计数T细胞在488nm处迸发膜结合DI-4-颜料，用流式细胞仪测定其在570(FL2通道)和630(FL3通道)nm处的发射。用613nm绿光激光迸发抗Thy-1抗原，613nm绿光迸发T细胞，萤光团在668nm(FL4通道)处发射。膜序的变化采用比值-米制GP公式量化，其中负值表示“紊乱”，正值反映膜中的“顺序”。未处理淋巴结细胞以Di-4-染色和抗Thy-647标记作为对照，其比值为0.35度规的广义极化(GP)值。70m7-KC处理细胞的平均GP值为-0.6，而35M和17.5μM尿酸处理的70M细胞的平均GP值分别为-0.05和-0.1，差别有显着性(P值分别为-0.05和-0.1平均GP值)。A、B)。35μM7-KC处理细胞的GP值平均为0.2，用35M和17.5μM尿酸重组后的GP值约为0.35。A、B)。用17.5μM7-KC(0.35gp值)可形成极小的膜衰弱，用35M和17.5μM尿酸重组时，膜衰弱程度在GP量表上分别为0.4和0.45(如图所示)。A、B)。相比之下，0.018~0.018mmMβCD载体对照细胞与对照细胞(未处理细胞)相比较(图1)。B；0.35-0.4GP值)。结果表明：70m7-KC使平衡从有序相明显转变为无序相，添加35M尿酸可明显改变膜的有序性，但重组膜次序显著高于未处理和载体(0.3mmMβCD处理细胞)对照组(如图所示)。a)。我们的数据表明，7-KC曝露后，T细胞膜次序发生了剂量依赖性的改变，只有35M尿酸处理的细胞能够观察到膜序的显著构建，而用17.5μM尿酸的重组作用最小。
图1
Di-萤光染色后T细胞膜排列和衰弱的评估。淋巴结细胞经di-染色后，用抗Thy-647染色.以7-KC和(或)不同含量的甘油三酯和MβCD载体对照(白色盒)计数T细胞亚群。在570nm处发射，波谱移至630nm，分别表现为FL2和FL3通道的平均萤光指数(MFI)、膜有序性和无序性。典型实验点图显示有序(X轴)和无序(Y轴)膜携带T细胞(A-上面板)和以RGP值表示的不同医治组的次序和衰弱的量化(B-下边板)显示。对照组(非医治组)在实验开始(第1次对照)和结束时(第2次对照)进行剖析。所有数据从5个独立试验中估算。错误条表示标准错误。用JMP程序进行单向残差剖析和TUKEY后剖析，估算各组间的统计学意义。具有不同联接字母的组之间有显着性差别。(P
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膜序重建后抗体特异性T细胞应答的恢复
接出来，我们研究了脂筏基膜序在CD4抗体特异性克隆扩增中的作用。+T细胞7-kc和/或尿酸处理的淋巴结细胞与剌激的c-ova一起孵育。323–339，或控制c-–334，肽作用48和72h，我们用MTT比色法测定CD4细胞的增殖反应。+T细胞MTT法测定细胞培养中与活细胞数和增殖细胞数密切相关的代谢活性。,。图形作为对c-ova的回应323–33970m7-KC处理的淋巴结细胞在48h时的增殖率约为未处理对照组的4倍。经70m7-kc处理的细胞增殖减小，类似于无抗体细胞培养或无剌激控制肽c-ova存在时的反应。324–334(覆盆子)a)。低含量7-kc对Cova的抑制作用323–339D_(11)CD4肽特异性增殖反应的研究+T细胞含量依赖性(图1)。17.5m7-KC曝露仅比未接受7-KC医治的对照组低0.5倍。a)。70M7-KC处理的淋巴结细胞，与未重组的70M7-KC培养相比，与未重组的70M7-KC培养相比，其膜序与35M固醇作用后的增殖反应均无显著恢复(P值>0.5)(P值>0.5)。a)。35M固醇可明显(p值a)。用17.5M固醇进行重建后，细胞增殖发生微小变化。
这是用7-KC处理细胞后重建膜衰弱所用的最低含量(70M，35M，17.5M)。a)。C-ova对T细胞增殖反应的研究323-3390.3mmMβCD载体控制组的肽与未根治的对照组相像(在0.3mmMβCD不存在时)，这种对照实验否认了7-KC±胆固醇的特异性作用。在细胞中加载额外固醇(35M&17.5M固醇医治组)，在没有任何之前接触7-KC的情况下，没有表现出提高的增殖反应(图1)。a)。这种反应与在c-ova剌激下形成的反应相像。323–339单用氨基酸，但显著低于“不医治组”和接受c-ova的培养。324–334控制肽后两组为阳性和特异性对照。CD4+具有尿酸膜次序的T细胞对c-ova的反应323–339肽，72h时出现重组增殖。反应趋势和剂量效应遵守48h时观察到的规律。简单地说，作为对c-ova的回应323–339，70个经m7-kc处理的淋巴结细胞与两种对照培养物的增殖能力相当，其中一个具有c-ova。324–334非剌激性肽，第二，在没有抗体的情况下(如图所示)。b)。据悉，7-kc处理细胞，作为对剌激c-ova的反应。323–339肽，增殖量比未处理的细胞低7.3倍。
C-–33935M7-KC处理的DO11T细胞形成的肽特异性反应也显著降低，但与70M7-KC处理的细胞相比，差别有显着性(PB)。重组70m7-KC处理的淋巴结细胞经35M固醇处理后，其增殖无显著变化(p值>0.5)。b)。35μm固醇可明显重建35M和17.5M7-KC处理细胞的细胞膜次序(分别为未加固醇细胞的3倍和1.2倍)(p值b)。
图2
CD4抗体特异性增殖反应+有有序和无序膜的T细胞。用不同含量的7-KC-MβCD复合物和(或)不同含量的固醇-MβCD复合物和MβCD载体对照处理淋巴结细胞10min。剌激肽c-ova的增殖反应323–339或控制肽c-–33448岁后接受检测(A)和72(B)37℃孵化器孵育小时。在细胞培养中加入20倍量的MTT试剂，并在总孵育时间的最后4h内进行孵育。每种培养物的光密度都挺好，反映了抗体特异性CD4。+T细胞增殖反应，在490nm处用96孔板阅读器读取。所有数据从5个独立试验中估算。错误条表示标准错误。用JMP程序进行单向残差剖析和TUKEY后剖析，估算各组间的统计学意义。不同联接字母组间差别有显着性(p
全规格图象
综上所述，我们的数据表明，尿酸显著地重建了由7-KC造成的膜衰弱，并呈剂量依赖性。重要的是，323–在7-KC诊治中的特异性增殖反应+T细胞经尿酸膜次序恢复后显著重建。
讨论
T淋巴细胞抒发抗体受体，与其膜结合卟啉联接后启动讯号传导.初期的时空讯号风波发生在质膜的脂类环境中。模型膜的实验证明了磷脂的自组织行为为液体有序(L)。o)和无序(Ld)饱和脂类和血脂生成有序的阶段。相反，不饱和磷脂推动衰弱。d相)在这种模型膜中,,,,,,。真核细胞质膜中有序和无序相的存在是有争议的，其对细胞反应生理学的贡献尚不清楚。据悉，有序区域的组成异质性,，尿酸与蛋白质在微团簇中的联系挑战了含有固醇有序结构域的细胞讯号传导作用。,。许多关于有序膜结构域在细胞讯号传递中的作用的证据都是使用当插入细胞膜时会形成衰弱的化合物而出现的。,,,,,。增加细胞尿酸的生物物理或遗传学方式早已形成了经验证据来支持膜序在细胞讯号传递中的作用。,,。但是，在膜衰弱细胞重建其膜序后，细胞讯号的恢复缺少直接的证据。我们的数据表明，尿酸可以通过抗体受体恢复其细胞讯号。这种实验证明了尿酸依赖的膜序(L)的关键作用。o)CD4抗体特异性克隆扩增。+T细胞
膜有序是由各类组成的异质膜结构域贡献的，这种结构域含有或不含甘油三酯。而广泛研究的含有饱和醇类、胆固醇和糖类锚定蛋白的脂筏(Lrs)是报导的有序膜结构域。,,,在质膜上也存在无尿酸的含有鞘脂的有序结构域，对膜的有序性也有贡献。。这种有序结构域在大小(10-100nm)和蛋白质组成上是不均匀的。,,,,。通过消除尿酸或将氧化方式的固醇插入膜中，导致膜衰弱，进而抑制CD4。+T细胞反应，因而被觉得是基于lrs/lr的脂类有序结构域和其他有序膜结构域在T细胞讯号和激活中的作用的实验证据。,,,,,。通过在无序膜中插入尿酸来恢复膜的有序结构域会形成含有固醇的有序结构域。那些可能是依赖尿酸的LRs，而不是无尿酸的含有鞘脂的有序结构域。LRs是T细胞中的一个子集，还是包含所有尿酸浓度高的有序膜结构域尚不清楚。组成非均质膜结构域之间的完整关系须要进一步的研究。
在质膜的脂类微环境中，由抗体受体(TCR)αβ(抗体受体)感知外源抗体，并由其相关的CD3氨基酸启动的质膜讯号级联发生。T细胞膜流动性对内禀次序(L)的影响o)和衰弱(Ld)初期讯号风波仍不清楚。尿酸和饱和脂筏在讯号分子分隔和促使细胞讯号传递中的作用仍然被提出。,,,。已知脂筏和纳米结构域有助于细胞讯号的时空调控。脂筏在抗体感知过程中结合在一起，并在免疫突触中富集。,,。CD4之间的互相作用+T细胞与抗体提呈细胞，以不依赖抗体的形式，推动脂筏结构域的结合。。T细胞固醇靶点基因水平的改变对其生物合成或调节细胞固醇水平(内流或流出)改变反应至关重要。。已知细胞膜和细胞器中尿酸水平的改变对观察到的细胞行为有贡献。。膜脂次序对细胞反应性的直接贡献尚不清楚。Di-萤光颜料在质膜外小叶的有限作用及其生物化学性质在固醇分子极性头群间的锚定作用让我们评估膜的流动性。一项已发表的报导显示细胞膜抗原，在细胞膜上加入di-后，细胞内没有大规模的内吞现象(改善)。相反，Hela细胞显示出一些颜料内化的证据。。为了在我们的原始淋巴样细胞实验中直接评估这一问题，我们在环境湿度下用Di-4-染色后，在共聚焦显微镜下对细胞进行了观察，并与4°C染色的细胞进行了比较。。其实我们不能排除颜料的个别内化，但在质膜上观察到大量染色(图2s)。这种性质的颜料，以寻问膜流动性在静止的中级淋巴样细胞，使我们可以直接评估抗体特异性T细胞讯号作用，尿酸依赖的膜序在质膜内。本报告颜料的特点报导了膜次序的生化重建，结合抗体特异性T细胞反应性的恢复，证明了尿酸在组织/推动膜L中的重要性。o以及细胞反应。
膜衰弱怎么破坏抗体传感器和/或受体讯号的机制尚不清楚。将Src激酶及其底物集聚在一起的脂筏集聚及其在参与TCR触发的下游讯号风波中的作用就是这样一种可能性。近来的研究显示CD4细胞间互相作用的RAFT结合作用。+T细胞和抗体提呈细胞，以不依赖抗体的形式据推断，这些细胞间的互相作用可能为正式发生的讯号风波和T细胞活化做好膜打算。。免疫突触是坐落互相作用的T细胞和抗体提呈细胞接触部位的初期T细胞活化风波的一个位点，它被浓缩成有序结构域的一部份。。中级CD4的初期激活风波+T细胞，通过p56的活化来评判莱克和LAT蛋白，不受膜序破坏的影响。,。但是，已发表的报导显示脂筏完整性对钙通量和AKT活化反应可能有影响。。这种观察表明，在原代T细胞中，通过抗体受体的讯号发生在膜筏外，其在细胞讯号传递中的作用仅在细胞膜近端讯号风波的后期或下游出现。与此相一致的是已发表的报告。。据悉，超区分显微镜显示抗体受体在天真T细胞质膜上的随机分布。。这种单聚抗体受体通过联接脂筏外的肽-mhc复合物而触发讯号。,。其实这种数据暗示了一些讯号的时空调控，但其他的报导显示尿酸分子与抗体受体的β链有特定的结合，这些互相作用在T细胞的激活和反应中起着重要的作用。,。未来的研究须要检测与抗体受体相关的固醇作用的相对贡献，以及与膜次序有关的固醇。