作者单位：浙江医科学院附属三院广东省妇婴保健院骨科病变实验室
DOI：/10.1186/-021-02211-2
明天小编给你们带来一篇2022年1月of&刊物的文章：LipidbytheTFEB-ERRαaxistoEC（IF=12.658）。据报导，雌激素相关受体α(ERRα)在卵巢内膜癌(EC)的进展中起关键作用。但是，ERRα介导的脂类重组在EC中的潜在机制尚不清楚。本研究阐述了转录因子EB(TFEB)-ERRα诱导脂类重组推动EC的进展。
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研究背景
高体重指数(BMI)影响病人当前和未来的健康，被觉得是全球男性死亡的五大缘由之一。在所有男性恶性病变中，卵巢内膜癌(EC)与肥胖的相关性最强，肥胖被觉得是更年期后妇女发生EC的一个特别重要的危险诱因。考虑到EC病人伴有超重和糖尿病的病状，病变脂类代谢仍然是研究的重点。但是，脂类代谢在EC中的作用机制尚不清楚。
雌激素相关受体α(-α，ERRα，NR3B1,ESRRA)属于核受体超家族，是一种具有组成性活性的非官能团孤儿核受体。作为一种转录因子，ERRα与其公认的共激活因子二溴化物酶体增殖激活受体(PPAR)共激活因子-1α(PGC-1α)结合，在调节细胞氧化乙酸化和脂类体代谢中发挥核心作用细胞膜流动性，进而形成许多生物学功能。
转录因子EB(EB,TFEB)是溶酶体生物发生和凋亡的主要调节因子，在不同癌症中具有重要的致病作用，TFEB通过PGC-1α和PPARα对脂类分解代谢进行全局转录控制。ERRα和TFEB在脂类代谢中的作用及其影响恶性细胞转移和侵袭的机制还有待进一步研究。该研究推断TFEB-ERRα讯号通过调节脂类代谢，广泛影响细胞膜功能，促使EC的侵袭和转移。
研究材料与技巧
借助肿瘤基因组图谱(TCGA)的RNA测序数据对TFEB和ERRα进行剖析和验证。采用双萤光素酶报告基因和染色质免疫沉淀定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)评估TFEB-ERRα轴。通过体外功能失去和功能获得实验来研究其机制。脂类组学和蛋白质组学测量TFEB-ERRα相关脂类代谢途径。扫描电镜观察假足。据悉，通过免疫组织物理和脂类组学对临床组织样本进行验证ERRα相关脂类。
结果
1、TFEB和ERRα在EC病人中高抒发，并与EC进展相关。
研究在TCGARNA-seq数据库中的543例EC样本和23例正常样本中研究了这两个基因的抒发和临床病理数据。TFEB高抒发与癌症进展程度明显相关(p0.05;图1B)。据悉，TFEB高抒发的EC病人的总生存期(OS)高于低抒发的EC病人(p系数=0.168;p<0.001;图1G)。
图1生物信息学剖析显示TFEB推动ERRα转录参与EC进展结果
2、ERRα是TFEB介导EC脂类代谢的直接靶向。
萤光素酶活性测量显示，TFEB的推动明显提高了ERRα抒发引起的相对萤光素酶活性(图1H)。为了进一步研究TFEB与ERRα之间的串导，研究进行了ChIP-qPCR，结果否认TFEB可以直接结合ERRαDNA的启动子(图1I)。其中，器件序列为3’--5’的P5位点最有可能与TFEB结合(图1J)。那些数据提示TFEB可以直接结合ERRα启动子并正向调节ERRα抒发。
ERRα是参与脂类分解代谢的关键调节因子。对高、低ERRα抒发组进行基因集富集剖析(GSEA)，阐述和鉴别ERRα在EC中的潜在功能。p<0.05，FDR<0.25被觉得明显富集脂肪酸(FA)代谢和脂肪生成(图1K)。该研究发觉FA代谢和脂肪生成途径都与癌症侵袭几乎明显相关(图1L)，这表明脂类代谢可能在EC的侵袭中起重要作用。
3、TFEB-ERRα主要影响富含甘油磷脂(GPs)的不饱和脂肪酸(UFA)
基于LC-MS/MS系统，筛选和鉴别了7类脂类，由1120种甘油磷脂(GPs)，345种鞘脂(SPs)，285种甘油脂(GLs)和其他脂质组成(图2A)。最后，测试了36类脂类，其中包括395种磷脂酰胆碱(PCs)，252种三甲基甘油(TAGs)，236磷脂酰乙酸胺(PEs)和其他脂类物种(图2B)。之后通过正交偏最小二乘判定剖析(OPLS-DA)评估脂类组学变化。人卵巢内膜癌细胞KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)存在显著的异质性，(图2C-D)。溶血磷脂酰乙酸胺(LPE)、二甘油酯(DG)、辅酶(Co)和蜡外物(WE)在KLE(TFEB–OV)中明显减少。KLE(ERRα–OV)病人双半乳糖二甲基甘油(DGDG)下降细胞膜流动性，神经节苷脂2(GM2)明显减少。虽然PC和鞘磷脂(SM)随TFEB或ERRα下降而变化不显著，但用于评估细胞膜流动性的KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)中PC/SM的比值均显著下降(p<0.05，图2E-F)。
作为TFEB的直接靶向，ERRα可明显下降7种脂类，包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰甘油(PGs)、心磷脂(CLs)、PE(18:1/20:5)、磷脂酰谷氨酸(PS)和神经丙酯(Cers)。KLE(ERRα–OV)中还测量到富含UFA的PC、PG、PS、SMs、CLs和PE(18:1/20:5)降低，饱和脂肪酸(SFA)富含的PC、PG和SM(40:0)降低(图2G)。据悉，KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)的重叠脂类分别为PC(35:1)+H、PC(36:3)+H和PG(18:1/22:6)+H。
结果表明，ERRα的加入降低了KLE的膜流动性。为此，TFEB驱动ERRα提升GPs中脂肪硝基部份的不饱和度，进而提高膜流动性，促使侵袭和转移。
图2ERRα下降EC中含不饱和脂肪酸(UFA)的甘油磷脂(GPs)
4、与ERRα相关的蛋白/脂类在EC的线粒体功能中富集
与对照组相比，用拮抗剂处理的KLE细胞获得了173个与ERRα相关的蛋白。这种蛋白的生物学过程主要富集于线粒体功能，细胞成份富集于锥体球状足生长(图3A)。结合蛋白质组学和脂类组学剖析发觉，含UFA的PC、PG、SMs与含SFA的PC、PG、SMs之间有32个蛋白存在明显差别(图3B-C)。剖析主要富集了线粒体功能(图3D)。
图3与ERRα相关的蛋白/脂类在EC的线粒体功能中富集
通常来说，在KLE和ECC-1细胞中，所有基因都随着TFEB-ERRα的下降而下调，随着TFEB-ERRα的增加而上调(图4A)。随即，通过能量剖析仪评估线粒体应激。与对照组相比，0.5µMFCCP处理的KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)细胞的最大耗氧率(OCR)下降，KLE(TFEB–KD)和KLE(ERRα–KD)细胞的最大耗氧率(OCR)增加(p<0.05)。KLE(TFEB−OV)和KLE(ERRα−OV)细胞的基础呼吸量、最大呼吸量和备用呼吸量等OCR相关指标均明显下降(p<0.05)。同时，KLE(TFEB−KD)和KLE(ERRα−KD)细胞的基础呼吸量、最大呼吸量和备用呼吸量均增长(p<0.05)。ATP水平与TFEB、ERRα呈明显正相关(p<0.05)。在ECC-1细胞中也观察到类似的趋势。为了进一步否认TFEB对ERRα介导的线粒体应激的影响，处理后，KLE(TFEB−OV)细胞和ECC-1(TFEB−OV)细胞中的ERRα水平被抑制。KLE(TFEB−OV+)细胞和ECC-1(TFEB−OV+)细胞的OCR无明显下降(p>0.05;图4B)。
图4与ERRα相关的蛋白/脂类在EC的线粒体功能中富集
膜磷脂的脂肪硝基部份的饱和程度决定了细胞膜的生物化学性质，如流动性。和是调节细胞膜中脂肪硝基部份饱和程度的关键磷脂重构酶。因而，该研究测试了FA去饱和酶蛋白和。与对照组相比，KLE(ERRα−OV)中/3下降。
与对照组相比，和在KLE(ERRα−KD)中的抒发均增加(p<0.05)。同样，测量ERRα后，MMP2和皮层肌动蛋白()也会发生改变(p<0.05;图4C)。
在ECC-1细胞中，/3、MMP2和皮层肌动蛋白的抒发也有类似的变化趋势。据悉，用处理KLE和ECC-1后，/3、MMP2和皮层肌动蛋白均显著遭到抑制。但是，当TFEB过抒发时，不能逆转这种蛋白(p<0.05;图4D).为了观察假足的形成，研究发觉KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)细胞的丝足比KLE细胞多，而经SCE处理后的KLE(ERRα–KD)和KLE细胞扫描到的细丝足较少。据悉，TFEB过抒发可去除的抑制作用，使球状足和伪足得以保留。与KLE细胞伪足一致，TFEB-ERRα推动丝足，医治的结果可能因TFEB下调而撤消。(图4E)这种数据表明，TFEB可以通过下调KLE和ECC-1细胞中的ERRα，诱导线粒体应激和磷脂重构，因而提升细胞膜的流动性。
5、TFEB通过EMT讯号通过ERRα推动EC迁移
尽管ERRα在推动EC侵袭转移中的作用已被否认，但其潜在机制尚不清楚。通过慢病毒介导的策略调节TFEB或ERRα的抒发后，KLE和ECC-1细胞的迁移能力发生了明显变化。与对照组相比，24h时KLE(TFEB–OV)、KLE(ERRα–OV)和ECC-1(TFEB–OV)的凹痕空间分别高达47.2%、21.9%和126.4%(p<0.05;图5A-B)。24h时ECC-1(ERRα–OV)的凹痕空间也略有降低，但与对照组比较差别无统计学意义(p>0.05)。与对照组相比，KLE(TFEB–KD)和KLE(ERRα–KD)细胞的损伤间隙在24h时降低了近2倍(p<0.001)。在ECC-1(TFEB–KD)和ECC-1(ERRα–KD)中观察到类似的趋势。为了进一步否认TFEB对ERRα介导的细胞迁移的影响，处理后，KLE(TFEB–OV)细胞和ECC1(TFEB–OV)细胞的ERRα水平被抑制。KLE(TFEB−OV+)细胞和ECC-1(TFEB−OV+)细胞的凹痕空间在0~24h无明显降低。
图5TFEB通过EMT讯号通过ERRα推动EC迁移
同时，经处理后，KLE(TFEB–OV)和ECC-1(TFEB–OV)细胞提高的迁移能力部份破损(p<0.05;图5A-B)。RT-qPCR结果显示，上调TFEB可减少ECC-1和KLE细胞中ERRα和波形蛋白()的抒发，降低上皮细胞钙粘蛋白(E-)的抒发。相反，TFEB过抒发可提升ERRα和的抒发，增加E-的抒发(p<0.05，图5C-D)。重要的是，10µM处理KLE(TFEB–OV)和ECC-1(TFEB–OV)细胞时，ERRα、和E-的抒发没有明显变化(p>0.05，图5F)，这表明TFEB可以通过EMT讯号通路以ERRα依赖的形式调节细胞迁移。
6、TFEB-ERRα的高抒发与EC病人血压异常和转移有关
为了验证上述结果，在EC组织微阵列(TMA)上进行了免疫组化，其中包括79个EC标本和32个正常卵巢内膜标本。
癌细胞和正常卵巢内膜腺细胞核中均测量到TFEB阴性免疫反应。EC组织的免疫反应性显著低于正常卵巢内膜组织(p<0.001;图6A)。同样，在79个EC组织样本中也测量到ERRα，其免疫反应性低于在32个正常卵巢内膜组织中测量到的ERRα(p<0.001;图6A)。不同国际妇产科联合会(FIGO)分期、组织学癌症分级、病理分型、淋巴结转移(LNM)情况下EC病人TFEB和ERRα抒发差别无统计学意义(p>0.05;图6C)。但是，EC病人TFEB和ERRα抒发在≤1/2和>1/2肌层浸润(MI)组之间存在明显差别(p<0.05;图6C)。据悉，TFEB与ERRα免疫反应性呈正相关。
有趣的是，在同一人群的血压研究中，EC病人的血浆总胆固醇(TG)水平明显低于健康人群，莱州度脂蛋白(HDL)和载脂蛋白a(APO-A)水平明显高于健康人群。据悉，卵巢内膜样子宫内膜癌(EEC)病人的低密度脂蛋白(LDL)水平显著低于非卵巢内膜样子宫内膜癌(NEEC)病人。重要的是，LNM病人的HDL和APO-A水平均明显减少。接出来，该研究比较了不同TFEB/ERRα抒发水平人群的血压差别。TFEB和ERRα高抒发组(++/+++)血浆HDL和APO-A水平显著高于TFEB和ERRα低抒发组(-/+)(p<0.05;图6D)。
综上所述，TFEB-ERRα下降参与了EC的侵袭和转移，并与血浆HDL和APO-A水平的增加有关。
图6几种蛋白的免疫组织物理抒发及其相关性显示
7、ERRα诱导的含UFA的GPs的积累是EC进展所必需的
从32例EC组织和19例正常卵巢内膜组织(3例不合格)中获得的脂类种类，包括359个PCs,324个TAGs,269个PEs和其他脂类种类(图7A-B)。Venn显示，三组病人中均监测到PG(18:1/22:6)+H、PC(36:3)+H两种脂类，KLE(ERRα–OV)和临床组织中均测量到19种脂类(图7C)。通过OPLS-DA评估EC病人与正常对照组之间的系统性脂类组学变化。人群之间存在显著的异质性(图7D)。据悉，EC组织中磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰谷氨酸(LPS)、溶血磷脂酰乙酸胺(LPE)和PG，鞘脂(SLs)(、、Cer和乙酸神经丙酯(CerP))以及单甘油酯(MG)和TG等GLs均下降。尽管SM下降不显著，但EC组织中用于评价细胞膜流动性的PC/SM明显下降(p<0.05，图7F)。据悉，EC组织中富含UFA的GP，如PC(18:1/18:2)+HCOO、PC(32:2)+H、PG(18:1/22:6)+H和SM(42:1)+HCOO与正常卵巢内膜相比显著下降(FC>1.5,VIP>1,p<0.05);图7F)。但与非LNM病人相比，LNM病人的PC(18:1/18:2)+HCOO显著低于非LNM病人(p<0.05;图7G)。单诱因二元回归剖析发觉，PC(18:1/18:2)+HCOO是晚期EC病人的独立危险诱因(p<0.05，图7H)。
据悉，研究比较了不同PC(18:1/18:2)+HCOO抒发水平人群的血压差别。结果表明,血浆莱州度脂蛋白水平低得多的高抒发病人PC(18:1/18:2)+HCOO比PC(18:1/18:2)+HCOO较低(p<0.05)。这种结果表明,ERRα诱导的PC(18:1/18:2)+HCOO降低是一种新的EC进展生物标志物,这可能与血浆莱州度脂蛋白的增加有关。
综上所述，TFEB-ERRα轴推动含UFA的GP积累，诱导以线粒体应激为特点的脂类重组，因而促使EC的侵袭和转移。重要的是，含UFA的PC、SM和PG是EC细胞和组织中明显改变的脂类，其中，TFEB-ERRα轴诱导的PG(18:1/22:6)+H参与了癌症发生，PC(18:1/18:2)+HCOO是介导EC转移的ERRα依赖性脂类。
图7ERRα诱导富含ufa的GPs的积累是EC进展所必需的
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点评
该研究发觉TFEB-ERRα讯号通路通过EMT通路和细胞膜流动性调控卵巢内膜癌细胞的侵袭转移。这一调控依赖于ERRα参与脂类代谢和细胞膜构建。TFEB-ERRα降低了UFA-PCs,PG(18:1/22:6)+H和PC/SM比值，因而提高了细胞膜流动性促使EC侵袭转移。
END
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