本发明涉及细胞工程学技术领域，具体涉及一种细胞膜功能化修饰技巧。
背景技术：
细胞膜是真核细胞的重要组成部份，它不但与细胞的分裂，增殖，迁移及坏死等息息相关，还在细胞与外部环境发生物质、能量交换中发挥重要作用。同时，细胞膜能够调节细胞-细胞互相作用，细胞-细胞通信和细胞内讯号传导途径。因而，对细胞膜进行功能化修饰，有利于推动基础细胞生物学研究，调控细胞间互相作用，操纵细胞讯号转导等。目前，已有大量的功能材料被修饰到细胞膜上，如dna，氨基酸，高分子材料等。在这种材料中，dna因其便于合成，结构可预测，可编程性强等优点而被广泛应用。目前常用的细胞膜修饰方式有：1.基于基因工程的技巧。该方式通过向细胞内导出新的基因，从而在细胞膜上持续抒发功能蛋白，进而实现细胞膜的功能化修饰。但是，这些方式不但操作复杂、耗时，并且可能会导致基因组成分的改变，给细胞研究带来不可预测的影响。2.基于静电吸附的技巧。细胞的膜表面带负电荷，它可以通过静电作用吸附带正电的材料(如聚乙烯吡啶(pei)、多聚赖谷氨酸(pll)等)，实现细胞膜的快速修饰。但是，这种带正电的高分子聚合物一般具有较高的细胞毒性，但是其在细胞膜表面的稳定性遭到培养基离子硬度的影响(静电屏蔽作用)，限制了其实际应用范围。3.基于细胞代谢的方式。
该方式利用人工合成的糖代谢前体将物理标签(如，叠氮官能团)整合到细胞膜表面糖基化蛋白上。借助温和的点击物理反应，将带有炔基标记的探针修饰到细胞膜上。这些方式繁杂历时，通常须要2-3天的代谢标记时间细胞膜蛋白，未能实现细胞膜的快速修饰。4.基于共价交联的技巧。细胞膜表面抒发大量的蛋白质分子，这种蛋白质中富含大量的甲基，乙基等活性羧基。通过酰基与琥珀酰吡啶酯(nhs)、巯基与马来酰吡啶酯(mal)等反应，将探针共价修饰到细胞膜表面。但该方式具有反应效率低，且涉及有机物理反应，可能形成较强的细胞毒性乃至影响细胞正常的生理功能。5.基于疏水端插入细胞膜的技巧。磷脂双分子层是细胞膜的主要组成成份之一，其两端具有亲水性，而中间部份具有疏水性。两亲性探针可以借助其疏水端与磷脂双分子层之间的相像相溶性质，自发锚定到细胞表面上。此方式因为具有快速高效、普适性强、生物兼容性好等优点，遭到了广泛关注。但是，目前通过这些方式修饰的探针在细胞膜上的稳定性较差，在复杂生物体系(如，富含血浆的培养基)中容易从细胞膜表面开裂。据悉修饰在膜表面的探针容易与其他成份发生非特异性互相作用，增加了探针的靶标辨识能力。
技术实现要素：
本发明的目的是借助dna纳米技术，建立两亲性dna多面体探针，开发一种新型的细胞膜修饰技巧。该方式不但能将探针分子快速、高效、无损地修饰到细胞膜上，就能明显提升探针在细胞膜上的稳定性及其分子辨识性能。据悉，基于dna纳米结构的可编程性，该方式可实现多种功能模块在细胞膜的高效自组装，为细胞分子生物学、组织工程及基于细胞的诊治等领域的研究提供了新技术。
本发明的目的是通过以下方法实现的：
一种细胞膜的功能化修饰方式，通过dna多面体上修饰的疏水分子的疏水作用将其插入到细胞膜磷脂双分子层，因而实现多面体在细胞膜表面的锚定，在dna多面体没有修饰疏水分子的顶点延展出dna序列，或则通过延展出的dna序列与其它功能单元结合完成细胞膜的功能化修饰。
所述的细胞膜的功能化修饰方式，dna多面体探针具有四个顶点，其中三个顶点均修饰有疏水分子。
所述的细胞膜的功能化修饰方式，疏水分子包括：尿酸、二甲基脂类体或生育酚等。
本发明在dna多面体没有修饰疏水分子的顶点延展出dna序列，可以用于细胞膜上分子特异性辨识。
所述的细胞膜的功能化修饰方式，其他功能单元包括：核苷酸分子，核苷酸适配体、脱氧核酶、小分子、多肽、蛋白或纳米颗粒等。小分子包括：抗生素类小分子或发光官能团小分子等，抗生素类小分子包括ce6等。纳米颗粒包括：金纳米颗粒，磁纳米颗粒等。
本发明还可以通过延展出的dna序列与其它功能单元结合，实现各类功能。
例如：
功能单元为核苷酸适配体，其与dna多面体延展出的dna序列互补杂交，可以实现细胞膜特异性辨识及细胞间选择性团聚。
功能单元为抗生素小分子，与dna多面体延展出的dna共价交联，可以实现根治等功能。
功能单元为发光官能团小分子，与dna多面体延展出的dna共价交联，可以实现成像等功能。
所述的细胞膜的功能化修饰方式，合成多面体所需的四条dna链，其中s1,s2,s3均被尿酸()修饰；
s1-cho:
-,如.1所示。
s2-cho:
-,如.2所示。
s3-cho:
-,如.3所示。
s4:
；如.4所示，顿号的核苷酸为延展序列。
所述的细胞膜的功能化修饰方式，
探针(即一种核苷酸分子，能特异性辨识并结合抒发在细胞表面的ptk7蛋白，从而与高抒发这些蛋白的细胞进行特异性结合)与s4中顿号核苷酸所示序列(即延展dna序列)互补；探针序列为：
，如.5所示。
上述序列仅仅为一个具体的优选反例，本发明方式中涉及的dna多面体序列不限于上述具体的序列，只要四条序列之间满足产生dna多面体结构，并且三个顶点均被疏水分子修饰即可。
本发明延展出的dna和与之相连的构成多面体的序列之间设置5-8个随机核苷酸序列(满足不影响多面体正常产生的核苷酸，不影响探针辨识功能即可，如5-8个t或a等)更有利于延展出的dna特异性辨识或则结合其他功能单元。
萤光官能团修饰核苷酸的位置只要不影响多面体以及延展序列的功能即可。
所述的细胞膜的功能化修饰方式，合成的多面体探针与细胞膜结合时体系中含量达到优选250nm。
所述的细胞膜的功能化修饰方式，合成的多面体探针与细胞膜结合反应时间优选10分钟。
本发明技术方案的详尽阐释：
1)两亲性dna多面体探针的制备
该dna多面体探针具有四个顶点。其中三个顶点分别修饰一个疏水分子(比如，尿酸分子)，这种疏水分子可通过疏水作用插入到细胞膜磷脂双分子层，因而实现多面体探针在细胞膜表面的锚定。用第四个顶点延展出一段特定的dna单链序列，借助这段dna序列或则通过dna互补杂交引入其他功能单元(比如，核苷酸适配体、脱氧核酶、小分子、多肽、蛋白等)，可用于实现细胞膜表面的分子辨识或生物催化或医治或成像等功能。多面体经过三个顶点的疏水性处理才能大大降低其在细胞膜表面的结合和稳定性，并且多面体具有良好的刚性及明晰的三维结构，有利于探针分子远离细胞膜表面并保持有序的空间定向，进而降低探针的靶标辨识能力。同时，探针分子模块选择的多样性促使该方式便于制备一系列具有特定功能的膜锚定探针。
两亲性多面体探针的制备流程如下：将合成多面体所需的四条dna链
s1-cho:-,
s2-cho:-,
s3-cho:-,
s4：
。
上述s4序列中粗体显示的7个t即延展出的dna和与之相连的构成多面体的序列之间设置的随机核苷酸序列。
将上述序列溶化到pbs缓冲液中(ph＝7.4，镁离子含量为5mm)，使所有dna链条的最终含量均为2μm，之后将该混和滤液在95℃下加热3分钟，平缓降至温度，进而制备获得两亲性dna多面体探针t-cho3，假如s4的7个t的随机核苷酸序列中的宋体的核苷酸t进行萤光官能团的修饰，则获得t-cho3-fam(用于本发明施行例中的t-cho3-fam制备)。
由s1-cho,s2-cho,s3-cho,s4及可制得探针t-cho3-sgc8；
序列为：(制备时体系中的含量2μm)
。
由单个尿酸修饰的单链dna分子s-cho1与可制得探针s-cho1-sgc8；
s-cho1序列为：-，如.6所示。
2)表征两亲性多面体探针
2.1)聚丙烯丙酯凝胶电泳表征两亲性多面体探针
用5％聚丙烯丙酯凝胶电泳表征所制备的探针t-cho3。取10μl样品，加入2μl甘油并充分混和。将混和液加入到5％的聚丙烯丙酯凝胶中，并在110v电流下进行45分钟电泳实验。实验结束后，用颜料对聚丙烯丙酯凝胶染色15分钟，之后用水清洗两次，并用凝胶成像仪对样品成像。如图1所示，s1-cho,s2-cho,s3-cho和s4反应后挺好的产生了探针t-cho3(泳道7)。
2.2)原子力显微镜成像表征两亲性多面体探针
取15μl制备的t-cho3探针，加入5μl含量为300μm的硫酸镍，在温度下混和5分钟。将混和液滴到云母片，并静置十分钟。用分馏水将云母片表面清洗三次，并在氢气气氛中进行干燥。干燥后的样品在原子力显微镜下进行成像。如图2所示，原子力成像表明合成的t-cho3探针呈均匀，单分散的颗粒状，其大小为10纳米左右。
3)尿酸修饰数量对多面体探针在细胞膜上稳定性的影响
细胞计数后，取30万个cem细胞，pbs漂洗一次，并均分为3组，之后分别与250nm的t-cho1-fam(dna序列为与t-cho3-fam相同的多面体，但只修饰一个尿酸)，250nm的t-cho2-fam(dna序列为与t-cho3-fam相同的多面体，但只修饰两个尿酸)和250nm的本发明方式制备的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分钟，pbs漂洗一次，分散到富含10％fbs的1640培养基中。三组细胞均在37℃，5％氧气环境下分别培养0小时，0.5小时，1小时，1.5小时，pbs漂洗一次，共聚焦成像观察探针开裂情况。如图3所示，探针t-cho1-fam锚定效率低，且开裂速率快，在半小时内几乎全部开裂。t-cho2-fam相较于t-cho1-fam锚定效率提高，开裂速率减缓，但仍远高于t-cho3-fam。
4)t-cho3-fam两亲性多面体探针膜锚定条件优化：
4.1)膜锚定含量优化
细胞计数后，取60万个cem细胞(人急性淋巴细胞肺癌t淋巴细胞)，pbs漂洗一次，并均分为6组，之后分别与15.6nm,31.2nm,62.5nm,125nm,250nm,500nm的t-cho3-fam探针在4℃下共孵育10分钟，pbs漂洗一次，流式细胞仪测量。如图4所示细胞膜蛋白，随着探针含量的降低，萤光位移显著降低，当探针含量达到250nm时，探针基本饱和。表明了两亲性多面体探针的高效膜锚定能力。
4.2)膜锚定时间优化
细胞计数后，取60万个cem细胞，pbs漂洗一次，并均分为6组，之后分别与250nm的t-cho3-fam在4℃下共孵育1分钟，2分钟，5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，pbs漂洗一次，流式细胞仪测量。如图5所示，萤光位移值随孵育时间降低而降低，到10分钟基本饱和。表明了两亲性多面体探针能快速锚定到细胞膜。
本发明的有益疗效
本发明通过制备两亲性dna多面体探针，发展了一种新型的细胞膜修饰技巧。与传统的细胞膜修饰方式(如基于基因工程的方式，基于共价交联的方式及基于细胞糖代谢的方式)相比，该方式能实现快速高效的细胞膜修饰。其修饰时间减短到10分钟，修饰所需的探针含量也低至250nm。与常规的两亲性探针(如尿酸修饰的单链dna探针)相比，两亲性dna多面体探针具有更高的膜稳定性(开裂速率大大增加，内吞效率也显著减少)。同时，dna多面体探针在细胞膜上的靶标辨识能力也相较于常规的两亲性探针提高3倍。
附图说明
图1为聚丙烯丙酯凝胶电泳表征探针的产生。条带1：s1，条带2：s1+s2,条带3:s1+s2+s3,条带4:s1+s2+s3+s4,条带5：s-cho1+s2+s3+s4,条带6：s-cho1+s-cho2+s3+s4,条带7：s-cho1+s-cho2+s-cho3+s4(t-cho3)。
图2为原子力显微镜成像表征本发明两亲性dna多面体探针的产生；
图中比列尺代表100nm。
图3为尿酸修饰数量对多面体探针在细胞膜上稳定性的影响；
(a)为共聚焦表征三种探针膜开裂速率，图中比列尺代表10μm；
(b)为萤光统计表征三种探针开裂速率。
图4为流式优化探针膜锚定含量。
图5为流式优化探针膜锚定时间。
图6(a)为共聚焦表征两种探针膜开裂速率，图中比列尺代表10μm；
(b)为萤光统计表征两种探针开裂速率。
图7(a)为共聚焦表征两种探针的内吞效率，箭头指示了内吞步入细胞的探针，图中比列尺代表10μm；
(b)为萤光统计表征两种探针的内吞效率。
图8(a)为细胞集聚效率的统计，
(b)为romos细胞膜表面中单条sgc8探针导致的细胞集聚起始速率。
具体施行方法
以下结合施行例借以进一步说明本发明，而非限制本发明。
施行例1：本发明两亲性多面体探针在细胞膜上的稳定性
两亲性多面体探针增加的开裂速率
细胞计数后，取20万个cem细胞，pbs漂洗一次，并均分为2组，之后分别与250nm的s-cho1-fam(序列为：-//--,代表该处的核苷酸t被萤光官能团修饰)和250nm的本发明方式制备的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分钟，pbs漂洗一次，分散到富含10％fbs的1640培养基中。两组细胞均在37℃，5％氧气环境下分别培养0小时，0.5小时，1小时，1.5小时，pbs漂洗一次，共聚焦成像观察探针开裂情况。如图6所示，探针s-cho1-fam在半小时内几乎全部开裂，而探针t-cho3-fam虽然在1.5小时，也只有不到20％的开裂。阐明了本发明使用的两亲性多面体探针相对于传统两亲性探针大大增强了在细胞膜上的稳定性。
施行例2：本发明两亲性多面体探针增加的内吞效率
细胞计数后，取20万个cem细胞，pbs漂洗一次，并均分为2组，之后分别与250nm的s-cho1-fam和250nm的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分钟，pbs漂洗一次，分散到富含5mm硫酸镁的pbs中。两组细胞均在37℃下培养15分钟，共聚焦成像观察探针内吞情况。如图7所示，探针s-cho1-fam在培养15分钟后，发生了显著的内吞，而探针t-cho3-fam无显著内吞。阐明了两亲性多面体探针相对于传统两亲性探针的大大增强了在细胞膜上的稳定性。
施行例3：本发明两亲性多面体探针在细胞膜上提高靶标辨识能力
细胞计数后，取20万个ramos细胞，用白色活细胞示踪剂()在37℃下染色15分钟,pbs漂洗一次，并均分为2组。之后分别与250nm的t-cho3-sgc8探针和250nm的s-cho1-sgc8探针在4℃下共孵育10分钟，pbs漂洗一次，分散到富含2％牛血清白蛋白(bsa)的dpbs中。再取200万个cem细胞，均分为两组，分别加到上述两组ramos细胞中，并在温度下晃动()10分钟，20分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，240分钟，360分钟，540分钟。用共聚焦显微镜对不同时间点的样品进行成像，统计细胞图团聚效率。如图8所示，t-cho3-sgc8探针修饰的ramos细胞才能快速辨识cem细胞，并导致高效的细胞团聚(60分钟后，集聚效率超过了85％)。同时，这些细胞集聚状态有较高的稳定性，虽然720分钟后，细胞集聚效率仍高达60％。但是，s-cho1-sgc8探针修饰的ramos细胞对cem细胞的辨识能力较差，在30分钟时，细胞的集聚效率达到最高峰值(仅约为25％)，此后快速增长，说明了在s-cho1-sgc8探针体系中，细胞集聚状态的稳定性较差。通过估算romos细胞膜表面中单条sgc8探针导致的细胞集聚起始速率，可以得出t-cho3-sgc8的分子辨识能力要显著低于s-cho1-sgc8探针3倍。
序列表
青海学院
一种细胞膜的功能化修饰技巧
.0
57
dna
未知()
57
dna
未知()
57
dna
未知()
75
dna
未知()
60
60
dna
未知()
60
28
dna
未知()
技术特点：
技术总结
本发明公开了一种细胞膜的功能化修饰技巧。通过DNA多面体上修饰的疏水分子的疏水作用将其插入到细胞膜磷脂双分子层，因而实现多面体在细胞膜表面的锚定，在DNA多面体没有修饰疏水分子的顶点延展出DNA序列，或则通过延展出的DNA序列与其它功能单元结合完成细胞膜的功能化修饰。该方式不但能将探针分子快速、高效、无损地修饰到细胞膜上，就能明显提升探针在细胞膜上的稳定性及其分子辨识性能。据悉，基于DNA纳米结构的可编程性，可实现多种功能模块在细胞膜的高效自组装，为细胞分子生物学、组织工程及基于细胞的诊治等领域的研究提供了新技术。
技术研制人员：谭蔚泓;邱丽萍;李进
受保护的技术使用者：山东学院
技术研制日：2019.06.11
技术公布日：2019.08.27