细胞膜蛋白质的提取刘筱茜、叶尔江、王瑶琪、王国旭、赵昕毓01细胞膜及膜蛋白介绍02细胞破碎及纯化方式03蛋白质提取分离方式04收获与展望01细胞膜及膜蛋白介绍02细胞破碎及纯化方式03蛋白质提取分离方式04收获与展望1.1细胞膜介绍1）细胞膜结构第一章细胞膜及膜蛋白介绍1.1细胞膜介绍2）细胞膜功能第一章细胞膜及膜蛋白介绍1.2膜蛋白介绍1）分类第一章细胞膜及膜蛋白介绍1.2膜蛋白介绍2）膜蛋白特性外在膜蛋白通常为水溶性蛋白，主要靠离子键或其他较弱的物理键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，结合不紧密。内在蛋白多数为跨膜蛋白，通过自身的跨膜结构域与磷脂双分子层的疏水核心互相作用（跨膜结构域两端的带电荷的多肽残基与磷脂极性背部互相作用),因而结合十分紧密。第一章细胞膜及膜蛋白介绍1.2膜蛋白介绍3）膜蛋白为何如此重要？参与和调节细胞的各类代谢活动细胞与外界环境进行物质交换、能量转移和讯号传递的桥梁可产生通道、载体,对离子和一些可溶代谢物进行选择性转运参与细胞辨识和讯号转导,形成相应的生物学效应超过半数以上的己知膜蛋白被预测是抗生素作用靶向第一章细胞膜及膜蛋白介绍1.2膜蛋白介绍4）膜蛋白分离难点疏水性强分子量大相对可溶蛋白产率较低易形成沉淀、丢失第一章细胞膜及膜蛋白介绍01细胞膜及膜蛋白介绍02细胞破碎及纯化方式03蛋白质提取分离方式04收获与展望2.1细胞破碎方式1）方式分类机械破碎法（碾磨法、组织磨碎法、超声波法、压榨法、冻溶法）缩聚和自溶法物理处理法生物酶解法反复冻融法低渗裂解法依照研究对象细胞膜的硬度确定破碎方式第二章细胞膜破碎及纯化方式2.1细胞破碎技巧2）超声破碎法借助超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞飘浮液，使细胞破碎。
膜收获率高，而且操作较为复杂，但是可能破坏细胞膜完整性。用超声波和碾磨法对耐热耐碱性细胞株DG6的破碎情况进行了比较，研究发觉超声破碎法可完全破碎细胞成大小不同的颗粒，而加入碳化硅碾磨法得到的细胞颗粒大小较均一，但是保留了细胞膜的完整性。第二章细胞破碎及纯化方式2.1细胞破碎方式3）冻融破碎法and细胞置于高温下冷藏（约-15℃），然后在温度中融化，重覆多次而达到破壁作用。因为冷藏，一方面能使细胞膜的疏水键结构断裂，因而降低细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，产生冰碳化物，导致细胞膨胀而断裂。等采用冻融与匀浆结合的方式将细胞破碎，并采用染色法进行跟踪测量，可使细胞膜断裂而细胞核未断裂。第二章细胞破碎及纯化方式2.1细胞破碎方式4）低渗裂解法（low-lytic）借助渗透压的作用，胞外的水迅速溶入胞内，造成细胞快速膨胀而断裂的方式。第二章细胞破碎及纯化方式2.1细胞破碎方式5）酶溶破碎法（lysis）借助溶化细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁遭到部份或完全破坏后细胞膜蛋白，再借助渗透压冲击等方式破坏细胞膜，进一步减小胞内产物的私密性。
溶菌酶（）适用于革兰氏阴性菌细胞的分解，应用于革兰氏阳性菌时细胞膜蛋白，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶则处理较温和。第二章细胞破碎及纯化方式2.2细胞膜纯化方式1）细胞膜纯化细胞经破膜后粗质膜的制备常采用二级离心法,即首先低速离心将未破的细胞、线粒体、细胞核等沉淀,之后高速离心得到膜性成份。进一步纯化方式主要有电泳分离法、密度梯度离心法以及双水相萃取等方式。第二章细胞破碎及纯化方式2.2细胞膜纯化方式2）电泳分离法依照质膜与其它碎片所带电荷量不同进行分离。第二章细胞破碎及纯化方式2.2细胞膜纯化方式3）密度梯度离心法乳腺、睾丸、肝、淋巴细胞和纤维原细胞等多种组织细胞膜的制备均采用了密度梯度离心的方式。要想得到纯的细胞膜,非常是将质膜与亚细胞器膜分离,仅采用梯度离心的方式是难以完成的。第二章细胞破碎及纯化方式2.2细胞膜纯化方式4）双水相萃取法概念：借助物质在互不相溶的两水相间分配系数的差别来进行萃取的方式。双水相体系：将两种不同的水溶性聚合物的水碱液混和时当聚合物含量达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系。
产生缘由：因为共聚物之间的不相胺类，即共聚物分子的空间制约作用，互相难以渗透，不能产生均一相，因而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。第二章细胞破碎及纯化方式2.2细胞膜纯化方式优点缺点1.萃取操作条件温和2.产品活性损失少3.萃取体系具有较好的可调性4.设备投资小，操作简单5.含水量高6.便于放大1.双水相系统含较高含量的水溶性聚合物和盐，会带到产物中2.水溶性聚合物和盐借助率低3.通常只用于粗分离4）双水相萃取法常用的双水相体系1.共聚物/共聚物体系：聚乙二醇(简称PEG)/葡聚糖(简称)。2.共聚物/无机盐体系为:PEG/盐酸盐或乙酸盐体系。第二章细胞破碎及纯化方式01细胞膜及膜蛋白介绍02细胞破碎及纯化方式03蛋白质提取分离方式04收获与展望3.1表面活性剂提取法1）常用表面活性剂目的：增溶。类型：可分为离子型、非离子型和两性表面活性剂,处理膜蛋白质时可产生去污剂-蛋白质混和体系。助溶机理：（1）增溶机理（2）置换机理第三章蛋白质提取分离方式3.1表面活性剂提取法去垢剂的选择原则通常去垢剂分离膜蛋白时,须要考虑去垢剂的溶化能力和温和性。
强离子去垢剂，如SDS，尽管具有挺好的溶化性能，但容易导致蛋白质变性；弱离子型或非离子型去垢剂对蛋白变性影响较小,但溶化能力较差。第三章蛋白质提取分离方式3.2试剂盒提取法1）提取原理裂解细胞后，先离心分离出质膜粗提物，再借助特殊的抽提，选择性地分离提取膜蛋白。抽提含一种特殊的去污剂，在4℃时所有的蛋白质均可都溶于抽提，但在37℃时，抽提分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中，根椐该性质分离出膜蛋白。提取方式简单，可靠，快速。第三章蛋白质提取分离方式3.2试剂盒提取法2）试剂盒的组成40ml150ml22.0mlTM-PEKA2.0mlTM-PEKB0.4mlSetIII（存储：六个月以内可置于4度保存，常年储存在零下二十度下，使用之前置于温度下）第三章蛋白质提取分离方式3.2试剂盒提取法3）试剂盒的使用方式细胞或均浆组织用1溶化并通过离心使胞质可溶性部份与不可溶性的膜部份进行分离。
用2A或2B将膜蛋白从脂类单层分离。或2B提早用提取稀释TM-PEKA或则B。作用比较缓和，可以回收一些易碎蛋白的复合体。是一种高效的提取试剂，有利于回收一些无法提取的膜蛋白。第三章蛋白质提取分离方式3.2试剂盒提取法4）试剂盒的使用步骤制备缓冲液2A，2B。从培养瓶中倒掉原氨水。用PBS于4℃洗涤细胞两次。加入3mL的PBS到培养容器中并转移细胞到15ml锥形管中。离心后漂浮细胞于1ml提取缓冲液1+10下挫蛋白酶抑制剂III中。在4℃下孵育10分钟并轻轻搅拌以防止产生细胞结节。.离心后取出碱液并储存在冰中，分离出可溶蛋白质。重新漂浮于0.2ml提取液2A+5下挫蛋白酶抑制剂III或0.2毫升提取液2B+5下挫蛋白酶抑制剂组III中。温度下孵育45分钟并轻轻搅拌。（降低温育时间可以降低蛋白质回收，但可能会造成减少靶蛋白的活性。反之，孵育在高温（4℃）可以更好地保存的活性，但可能会增加萃取效率。离心后将滤液转移至新管，得到整合膜蛋白。
第三章蛋白质提取分离方式01细胞膜及膜蛋白介绍02细胞破碎及纯化方式03蛋白质提取分离方式04收获与展望4.0收获与展望1）双水相萃取的应用去污剂/聚合物双水相体系结合了去污剂对膜蛋白的增溶作用及成相物质含量低的特性,用于低含量、痕量成分的分离检查,保证生物活性物质在其中分配不易失活变性,有望成为膜蛋白分离纯化的热点。第四章收获与展望4.0收获与展望2）模拟研究的新技术??等人研制出一种脂类纳米圆盘来取代细胞膜上磷脂单层膜，让被纯化下来的细胞膜蛋白还能与通常细胞膜蛋白一样行使其正常功能。这些纳米圆盘的结构如同通常细胞膜一样，由两层背对背的磷脂所组成，为了使纳米圆盘表面保持平坦，其研究小组模仿制做台湾拉面的形式，将其纯化下来的膜蛋白当作馅儿，将其磷脂当成肉松包装纸，使磷脂紧密围绕在膜蛋白周围。??第四章收获与展望参考文献[1]陈海霞，耿美玉，管华诗.细胞膜糖蛋白及其多糖链剖析方式的研究进展[J].中国生物工程刊物，2003,23(3)：20-24.[2]颜建华.去污剂与膜蛋白的提取[J].美国医学临床生物物理与检验学分册，1993,14(4)：162-164.[3]刘娟，朱建航，范杰平.去污剂/聚合物双水相体系在膜蛋白分离中的应用[J].四川科学，2008,26(3)：416-420.[4]胡锐.质谱联用技术研究细胞膜结构[D].上海：华东科技学院.2012.[5]周斌，刘晓东，王凤鹃，刘珂，陈溥言.PK-15细胞膜蛋白提取方式的比较及猪瘟病毒膜表面受体的初步鉴别[J].畜牧与兽医，2011,43(5):1-4.[6]Zhi-jianTan,Fen-fangLi,Xue-leiXu,Jian-minfú.andofaloeandusingionicbasedtwo-phasewith[J].,286(2012):389–393.[7]TheofKit..[8]JiaxiWang,Gao,Yan,Zhang.Anandin-situbased-forandofanditsintips[J].Acta.880(2015):77–83.感谢！觉得这个地方可以全中文弄起来~