近些年来，将纳米技术应用于防治和根治性疾病卡介苗的设计中取得了重大进展。但是，因为纳米卡介苗的组成复杂，抗体呈递细胞（APC）激活和抗体交叉呈递的时空协调困难，纳米卡介苗的临床转化一直遭到限制。开发具有天然刺激活性的卡介苗载体为进一步增强肿瘤纳米卡介苗的效率和转化潜力提供了一个有前景的方向，既可以简化卡介苗的设计和生产流程，进而推动卡介苗系统投放市场的速率；又有望更好地协调抗体交叉呈递和APCs激活，引起更强的免疫应答。
图1：PEI-M的设计和作用机制示意图
西安应用物理研究所宋万通副研究员、陈学思教授团队设计了一种极简的二元纳米卡介苗（BiVax），将天然刺激活性整合到载体中以引起强悍的抗肺癌免疫。首先制备了一系列唑类分子封端的聚乙烯吡啶(PEI-M)，超过60%的PEI-M聚合物通过激活干扰素基因剌激因子(STING)通路而具有天然的刺激活性。其中，PEI-4BImi，PEI-M库中表现最好的聚合物之一，通过简单地与卵清蛋白(OVA)抗体混和，可用作皮下注射的纳米卡介苗引起强悍的抗肺癌免疫反应。通过将PEI-4BImi与自体病变细胞膜蛋白抗体复合，实现了个性化BiVax的快速制备，与免疫检测点抑制剂联合使用时，术后医治率达到60%。这些BiVax系统的性能比传统的“三元”疫苗系统以及商业化的含铝佐剂要好得多，能用于个性化医疗，有望进行肿瘤卡介苗的临床转化。该研究以题为“Afor”发表在最新一期的《》上。
【PEI的设计与筛选】
对STING兴奋剂的结构剖析表明，对于与同型二聚体STING蛋白复合物的结合并在杂环结合口袋中产生构象进行互相作用，含氮配体结构至关重要。用50μg/mL的PEI-M培养大鼠DC2.4细胞24小时后，通过测量培养液中IFN-β的含量来评价这种PEI-M聚合物在细胞中的固有剌激效应。在检测的15个结构中，其中6种PEI-M聚合物可诱导DC2.4细胞分泌400pg/mL以上的IFN-β，而无论是PEI还是这种小分子都不能在相同含量下诱导DC2.4细胞分泌可测量到的IFN-β。评估了PEI-M中唑分子共聚物次数对剌激疗效的影响。PEI-4Imi的剌激疗效随着嵌段率的降低而降低，而PEI-5Thi和PEI-4BImi则以共聚物数40为最佳，当共聚物数降低到60时，剌激疗效大幅上涨。这可能是因为PEI上修饰了过多的疏水侧链，溶化性较差所致。
图2：PEI-M库的筛选
使用OVA蛋白作为模型抗体制备BiVax。通过简单的混和，PEI-M与OVA蛋白形成静电互相作用，很容易组装成纳米颗粒，水动力半径约为50-100nm。在系列稀释过程中，PEI-4Imi/OVA复合物可耐受52倍的稀释直至解体，说明了其对稀释的稳定性。评估了皮下注射PEI基BiVax后，局部淋巴结(LNs)中APCs的成熟情况。与游离OVA相比，PEI-M负载降低了淋巴结内抗体的积累。其中，PEI-4BImi其实是BiVax设计中表现最好的聚合物细胞膜蛋白，选择了PEI-4Imi进行后续的体内根治评价。
图3：BiVax的制备及体内鉴别
【BiVax的医治疗效】
评估了使用PEI-4BImi作为卡介苗载体设计的BiVax在B16-OVA黄色素瘤模型中的医治疗效。与其它组相比，PEI-4Imi/OVA对B16-OVA的抑制疗效最好，第22天的癌症抑制率为83.2%。PEI-4BImi/OVA处理的大鼠脾细胞在脉冲孵育OVA肽或蛋白时比其他组分泌更多的IFN-γ，这表明PEI-4BImi/OVA处理组诱导了更多的抗体特异性T细胞。剖析了不同配方的OVA卡介苗接种健康大鼠外周血的免疫反应。与其他医治组相比，PEI-4BImi/OVA接种后的IFN-γ+、CD4+T细胞和IFN-γ+、CD8+T细胞的比列要高得多，否认PEI-4BImi/OVA接种提升了大鼠强烈的T细胞应答。PEI-4BImi/OVA免疫大鼠的抗体特异性裂解率达80%以上，远低于其他各组，说明PEI-4BImi作为卡介苗载体能高效诱导抗体特异性免疫应答。
图4：作为BiVax的PEI-4BImi/OVA体内根治相关表征
【BiVax个性化卡介苗平台】
构建了大鼠的术后恶变的直肠癌症模型，从摘除的癌症中提取MC38癌症细胞膜蛋白，获得个性化的癌症抗体(MAg)，并将PEI-4BImi与MAg简单混和制备个性化的BiVax(4BImi/MAg)。与其他组相比，4BImi/MAgBiVax对术后胃癌恶变的抑制疗效更好，术后第19天的癌症抑制率为88.6%，医治率为33%。当4BImi/MAgBiVax联合免疫检测点抑制剂aPD-L1抗原时，第19天观察到癌症抑制率为96.9%，60%的大鼠完全医治；且医治大鼠未见病变恶变细胞膜蛋白，提示BiVax诊治后有效记忆作用的构建。这种结果表明，基于PEI-4BImi的BiVax系统用于术后医治的有效性和必要性。
图5：基于PEI-4BImi的BiVax作为个性化卡介苗平台
【小结】
综上所述，作者提出了一种用于BiVax设计和术后肿瘤卡介苗医治的极简卡介苗载体。发觉了将一种五元环唑衍生物封端PEI（PEI-M）后，可以通过STING途径有效剌激DC细胞分泌IFN，而且只需将PEI-M与蛋白质抗体混和即可制备BiVax。这种类型的BiVax优于传统的三元纳米卡介苗和商用铝基卡介苗。据悉，该BiVax平台就能快速制备用于术后肿瘤诊治的个性化卡介苗，当BiVax与aPD-L1联合用于术后MC38癌症医治时，60%的大鼠完全医治。该基于PEI-M的BiVax平台具有巨大的临床转化潜力。