红细胞膜蛋白提取鉴别内容1.红细胞膜提取2.膜蛋白提取及定量测定（Lowry法）3.膜蛋白电泳分离、分子量测定SDS.鉴别β-actin一.红细胞膜提取制备（低渗法）原理：RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，断裂溶血－－溶血液。溶血液置高速离心作用中，除去氨水中Hb和其它内含物，制得纯净的RBC膜－－称为血影“ghost”注意事项：1.离心步骤一定要“平衡、对称放置”2.溶血液离心后上清汲取留神，以免遗失“膜”3.缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留降低4.此分离方式适宜于人、大鼠；牛、猪等易使脂蛋白开裂，可避免此种膜的不稳定性。5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持蛋白活性细胞膜蛋白，应在4?C离心。（1）RBC分离：15mlRBC液5分钟RBC（沉淀）＋3倍容积等渗乙酸5分钟×2沥干之RBC（2）溶血液制备RBC加入低渗乙酸（>1:50)(在烧瓶中）稍搅拌置冰柜冻格（4?C）溶血过夜（以上步骤已完成！！）二、RBC膜纯化（漂洗）三、样品处理：1.SDS用样品处理（一大组）：0.3mlRBC面膜+0.3ml样品溶化液开水浴5’2.Lowry法测定用样品处理(3-4人/group）：A.取0.3mlRBC面膜＋1.5mlH2O＋150ulNaOH开水浴5’待测管1：取A液0.1ml＋0.9mlH2O待测管2：取A液0.3ml＋0.7mlH2O四、Lowry法测定膜蛋白浓度立刻拌匀细胞膜蛋白，放置15分钟。
以第６管为空白管，在分光光度计上以620ｎｍ比色，读取Ａ。以各管标准蛋白含量为横坐标，各管吸光度值为纵坐标画图，画出标准曲线。2.红细胞膜样品蛋白浓度的测定将待测管1、2同上加入酸性铜及酚试剂，一齐测定画图：横座标以标准蛋白浓度纵座标以A620吸光度值图比列应为3:2（横：纵）估算：在标准曲线上查出待测样品的含量，估算提取膜的Prmg数/ml样品注意稀释倍数要求：估算原提取RBC液的Pr浓度五、SDS测定膜蛋白分子量不连续电泳系统：电泳缓冲液pH离子硬度与凝胶中不同（浓缩效应）（一）垂直板安装每套板两块玻璃上端对齐，夹好，置于胶架上！（二）凝胶制备（见表）先配好分离胶（留距齿梳1cm），待其融化后，再配浓缩胶。（三）电泳装置安装先装内槽，试无漏水；装入外槽中，加。上样品：每孔18ul，2块/组每块板留一标准蛋白孔（四）电泳：100V进分离胶调至80V约1.5小时（五）取胶:用专用板平面轻轻“橇”开板，掉入小平皿中。注意：一块半干转移（溶入转移）另一块考马斯亮蓝染色染色2小时后，7%乙酸脱色（×4）每组做好标记（写好名子），交生化室扫描或摄像保留。
分子量估算1.检测：cma.每条带距离（起始点至带中心）b.起始至示踪颜料距离2.MR：条带距离(a)MR=起始至示踪颜料距离(b)六、(β-actin鉴别)1.转膜将与凝胶块(削去多余部份)通常大小的NC膜、滤纸均浸没转移中20分钟，取出，在半干转移槽中按以下次序放置：(上）阴极端滤纸-凝胶-膜-滤纸阳极端（下）用玻棒滚动消除空气气泡，盖好上盖。开启电源，调电流时间20v，20分钟2.封闭将膜取出TBST中洗5’，放置于封闭液中10分钟，用TBST洗5’×3；3.一抗孵育将膜装入已放一抗碱液塑胶袋中，温度孵育1小时，用TBST洗5分钟×3；4.二抗孵育将膜装入已放二抗碱液的塑胶袋中，温度孵育1小时，用TBST洗5分钟×3；5.DAB显色配制DAB显色液1ml（适量），取出膜装入DAB碱液中，显色（约10分钟内）；（试剂盒：分馏水1ml，A、B、C各一滴装入水底）6.结果扫描保存**实验报告要求：分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，推论手写，A4纸大小，报告首页写明实验者，专业。
实验分组每位班分三大组，每组十人左右，选出主任实验进行一大组为单位1.纯化RBC膜2.SDS块胶（一个凝胶架）3.blot4.3-4人一小组测定蛋白质浓度溶血液，用“水泵”吸去上清。！！：膜很轻RBC膜转至1.5ml塑胶管（2个/大组）5’沉淀（膜）＋低渗乙酸（pH7.4)?ml（吹打）’×4沉淀＋等渗乙酸分钟沉淀（RBC膜）＋0.6ml等渗（即为RBC面膜）02001501005025含标准蛋白ug３３３３３３酚试剂磨碎，放置１０分钟１１１１１１酸性铜试剂__0.80.60.40.20.1标准蛋白1.00.20.40.60.80.9H2O(ml)６５４３２１管号试剂1.标准曲线制备8ul8ulTEMED0.06(60ul)0.06（60ul)10％过硝酸铵0.080.110％SDS1.01mol/LTris-HCl2.51.5mol/LTris-HCl4.04.0分馏水1.03.330％凝胶储备液5％浓缩胶5ml10％分离胶10ml加入过硝酸铵，TEMED即刻灌胶。
ab1410062403024152535405570MR迁移距离cm分子量KD预染标准蛋白3.半对数图：（六条标准蛋白）（参照统计学散点法）横座标为迁移率MR纵座标为LogM（直接按每一蛋白分子量标在半对数图中）4.估算待测样品蛋白质分子量：选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三条带，检测距离估算MR，Mw9876543210.10.20.30.4….横座标为迁移率MR；（六条标准蛋白）纵座标为LogM（直接按每一标准蛋白分子量）2060100