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红细胞膜蛋白提取流程.ppt18页VIP

更新时间:2023-09-26 文章作者:佚名 信息来源:网络整理 阅读次数:

细胞膜蛋白提取鉴别内容1.红细胞膜提取2.膜蛋白提取及定量测定(Lowry法)3.膜蛋白电泳分离、分子量测定SDS.鉴别β-actin一.红细胞膜提取制备(低渗法)原理:RBC置低渗缓冲液(pH7.4),断裂溶血--溶血液。溶血液置高速离心作用中,除去氨水中Hb和其它内含物,制得纯净的RBC膜--称为血影“ghost”注意事项:1.离心步骤一定要“平衡、对称放置”2.溶血液离心后上清汲取留神,以免遗失“膜”3.缓冲液pH7.4,偏酸使Hb残留降低4.此分离方式适宜于人、大鼠;牛、猪等易使脂蛋白开裂,可避免此种膜的不稳定性。5.本实验因条件限制,在常温离心。如需保持蛋白活性细胞膜蛋白,应在4?C离心。(1)RBC分离:15mlRBC液5分钟RBC(沉淀)+3倍容积等渗乙酸5分钟×2沥干之RBC(2)溶血液制备RBC加入低渗乙酸(>1:50)(在烧瓶中)稍搅拌置冰柜冻格(4?C)溶血过夜(以上步骤已完成!!)二、RBC膜纯化(漂洗)三、样品处理:1.SDS用样品处理(一大组):0.3mlRBC面膜+0.3ml样品溶化液开水浴5’2.Lowry法测定用样品处理(3-4人/group):A.取0.3mlRBC面膜+1.5mlH2O+150ulNaOH开水浴5’待测管1:取A液0.1ml+0.9mlH2O待测管2:取A液0.3ml+0.7mlH2O四、Lowry法测定膜蛋白浓度立刻拌匀细胞膜蛋白,放置15分钟。JiC物理好资源网(原物理ok网)

以第6管为空白管,在分光光度计上以620nm比色,读取A。以各管标准蛋白含量为横坐标,各管吸光度值为纵坐标画图,画出标准曲线。2.红细胞膜样品蛋白浓度的测定将待测管1、2同上加入酸性铜及酚试剂,一齐测定画图:横座标以标准蛋白浓度纵座标以A620吸光度值图比列应为3:2(横:纵)估算:在标准曲线上查出待测样品的含量,估算提取膜的Prmg数/ml样品注意稀释倍数要求:估算原提取RBC液的Pr浓度五、SDS测定膜蛋白分子量不连续电泳系统:电泳缓冲液pH离子硬度与凝胶中不同(浓缩效应)(一)垂直板安装每套板两块玻璃上端对齐,夹好,置于胶架上!(二)凝胶制备(见表)先配好分离胶(留距齿梳1cm),待其融化后,再配浓缩胶。(三)电泳装置安装先装内槽,试无漏水;装入外槽中,加。上样品:每孔18ul,2块/组每块板留一标准蛋白孔(四)电泳:100V进分离胶调至80V约1.5小时(五)取胶:用专用板平面轻轻“橇”开板,掉入小平皿中。注意:一块半干转移(溶入转移)另一块考马斯亮蓝染色染色2小时后,7%乙酸脱色(×4)每组做好标记(写好名子),交生化室扫描或摄像保留。JiC物理好资源网(原物理ok网)

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分子量估算1.检测:cma.每条带距离(起始点至带中心)b.起始至示踪颜料距离2.MR:条带距离(a)MR=起始至示踪颜料距离(b)六、(β-actin鉴别)1.转膜将与凝胶块(削去多余部份)通常大小的NC膜、滤纸均浸没转移中20分钟,取出,在半干转移槽中按以下次序放置:(上)阴极端滤纸-凝胶-膜-滤纸阳极端(下)用玻棒滚动消除空气气泡,盖好上盖。开启电源,调电流时间20v,20分钟2.封闭将膜取出TBST中洗5’,放置于封闭液中10分钟,用TBST洗5’×3;3.一抗孵育将膜装入已放一抗碱液塑胶袋中,温度孵育1小时,用TBST洗5分钟×3;4.二抗孵育将膜装入已放二抗碱液的塑胶袋中,温度孵育1小时,用TBST洗5分钟×3;5.DAB显色配制DAB显色液1ml(适量),取出膜装入DAB碱液中,显色(约10分钟内);(试剂盒:分馏水1ml,A、B、C各一滴装入水底)6.结果扫描保存**实验报告要求:分别按上各点,写出:原理,操作步骤,结果,讨论,推论手写,A4纸大小,报告首页写明实验者,专业。JiC物理好资源网(原物理ok网)

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实验分组每位班分三大组,每组十人左右,选出主任实验进行一大组为单位1.纯化RBC膜2.SDS块胶(一个凝胶架)3.blot4.3-4人一小组测定蛋白质浓度溶血液,用“水泵”吸去上清。!!:膜很轻RBC膜转至1.5ml塑胶管(2个/大组)5’沉淀(膜)+低渗乙酸(pH7.4)?ml(吹打)’×4沉淀+等渗乙酸分钟沉淀(RBC膜)+0.6ml等渗(即为RBC面膜)02001501005025含标准蛋白ug333333酚试剂磨碎,放置10分钟111111酸性铜试剂__0.80.60.40.20.1标准蛋白1.00.20.40.60.80.9H2O(ml)654321管号试剂1.标准曲线制备8ul8ulTEMED0.06(60ul)0.06(60ul)10%过硝酸铵0.080.110%SDS1.01mol/LTris-HCl2.51.5mol/LTris-HCl4.04.0分馏水1.03.330%凝胶储备液5%浓缩胶5ml10%分离胶10ml加入过硝酸铵,TEMED即刻灌胶。JiC物理好资源网(原物理ok网)

ab1410062403024152535405570MR迁移距离cm分子量KD预染标准蛋白3.半对数图:(六条标准蛋白)(参照统计学散点法)横座标为迁移率MR纵座标为LogM(直接按每一蛋白分子量标在半对数图中)4.估算待测样品蛋白质分子量:选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三条带,检测距离估算MR,Mw9876543210.10.20.30.4….横座标为迁移率MR;(六条标准蛋白)纵座标为LogM(直接按每一标准蛋白分子量)2060100JiC物理好资源网(原物理ok网)

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