免疫萤光检查细胞膜上的抗体用通透免疫萤光基本实验步骤基本实验步骤：（1）细胞打算。对双层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成双层后取出盖玻片，PBS洗两次；对漂浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心漂洗（，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞活检。（2）固定。按照须要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可放在含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS漂洗3×5min。（3）通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，通常须要在加入抗原孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗原才能抵达抗体部位。选择通透剂应充分考虑抗体蛋白的性质。通透的时间通常在5-15min。通透后用PBS漂洗3×5min。（4）封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间通常为30min。（5）一抗结合。温度孵育1h或则4℃过夜。PBST洗涤3次，每次冲洗5min。（6）二抗结合。间接免疫萤光须要使用二抗。温度避光孵育1h。PBST洗涤3次，每次冲洗5min后，再用分馏水洗涤一次。（7）封片及测量。滴加封丸剂一滴，封片，萤光显微镜检测。
（一）细胞打算用于免疫萤光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后活检的漂浮细胞或则是将取自体内的组织细胞悬液离心后活检。贴壁良好的细胞通常在培养时直接装入让细胞生长在其上即可，尽量避开使用贴壁性能不好的细胞进行免疫萤光实验，以免后续的洗涤操作导致细胞开裂。少数实验须要使用这类细胞或则漂浮细胞进行免疫萤光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞活检。（二）固定和通透除研究细胞表面抗体或不稳定抗体可不固定外，通常均应固定。固定的目的有三：①防止细胞从玻片上开裂；②除去妨害抗体-抗原结合的类脂；③使标本便于保存。标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗体；②不能凝集蛋白质；③应保持细胞和亚细胞结构；④固定后应保持私密性，以保证抗原自由步入所有细胞与亚细胞组分与抗体结合。常用的固定剂有多种，应按照所研究抗体的性质和所使用的抗原特点选择适当的固定剂。一般固定方式可以分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如乙醇和乙酸等可消除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛一般通过自由多肽羧基产生分子间桥连，因而形成一种抗体互相联接的网路结构。
交联剂比有机溶剂更便于保持细胞的结构，但由于交联阻挠抗原结合，可能会增加一些细胞组分的抗体性，因而须要降低一个通透步骤以使抗原才能步入标本。两种固定方式都可能使蛋白抗体变性，因而使用变性蛋白作为抗体生产的抗原在免疫萤光中可能更为有效。最常用的固定剂有多聚甲醛和乙醇，少数情况也使用甲醇，乙醇及戊二醛等进行固定。一般，细胞结构抗体、病毒及一些酶类抗体使用乙醇、乙醇及高含量的甲醛固定可获得较好的结果细胞膜抗原，而细胞膜相关组分抗体通常以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗体通常也用多聚甲醛固定，并须要进行通透以使抗原能达到抗体表位。通透步骤只在检查细胞内抗体表位的时侯才须要细胞膜抗原，由于抗原须要步入细胞内部去测量蛋白。并且，假如待测量的是跨膜蛋白，且其抗体表位处于胞质内区域，则同样须要对细胞进行通透。相反，假如所测量的抗体表位坐落膜蛋白的胞外段，则不须要进行通透。乙醇本身具有通透作用，因而用乙醇作为固定剂时是不须要通透的。乙醇同样具有通透作用，但有些场合并不适宜用乙醇，由于一些表位对乙醇十分敏感。常用的通透剂是去垢剂，如，NP-40，以及Tween20,,和等。
和NP-40属于烈性去垢剂，可部份溶化细胞核膜，因而特别适宜核抗体检查。但应当注意的是，假如在高含量下使用或则作用时间过长，它们将破坏蛋白，进而影响实验结果。X-100是最常用的通透剂，并且它将破坏细胞膜，因而不适用于细胞膜相关抗体。前面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上产生足够大的孔隙以容许抗原通过，并且不会溶化细胞质膜。易于胞质抗体或则质膜上紧靠胞质一面的抗体，也易于可溶的核抗体。通常的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不胺类的目的抗体的测量宜先通透再固定，这样做的缘由主要是可以通过通透消除许多水溶性的蛋白，进而大大降低了免疫萤光的背景和非特异性讯号。固定后以冷PBS液洗涤，最后以分馏水冲洗，避免自发性萤光。（三）封闭封闭的目的是为了减轻抗原的非特异性结合，最常用的封闭剂为1%BSA,PBSpH7.5，其他可选择的封闭剂还有1%,1%或与二抗种生肖同的血浆（3-10%）等。（四）抗原孵育直接免疫萤光法中的一抗和间接免疫萤光法中的二抗都是萤光抗原，因而在这种抗原孵育的时侯必须注意避光。据悉，为保证结合质量和避免干燥，抗原孵育应尽量在湿盒中进行。
（五）封片及萤光观察标记好萤光的细胞片原则上可以直接进行观察，非常是有时侯封片不当反倒促使前功尽弃。但在绝大多数情况下，为了保存结果，便于进一步观察、照像、统计剖析等，需作封片处理。常规的方式是采用甘油或中性树脂封片，为了提高封片的疗效，常常须要在封片时添加特殊的抗萤光淬灭剂。（六）标本保存因为萤光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因而随着保存时间的延长，在各类条件影响下，标记蛋白可能变性解离，丧失其应有的照度和特异性。为此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行萤光染色过后应立刻观察。因为性能良好的抗萤光淬灭剂的出现，萤光标记的标本可以在高温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。在个别情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，例如固定标本片后高温保存，在须要时再进行萤光标记，即随用随染。