免疫萤光技术（）又称萤光抗原技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物物理和显微镜技术的基础上完善上去的一项技术。很早以来就有一些学者企图将抗原分子与一些示踪物质结合，借助抗体抗原反应进行组织或细胞内抗体物质的定位。它是按照抗体抗原反应的原理，先将已知的抗体或抗原标记上萤光官能团，再用这些萤光抗原（或抗体）作为探针检测细胞或组织内的相应抗体（或抗原）。借助萤光显微镜可以看到萤光所在的细胞或组织，进而确定抗体或抗原的性质和定位。
一、基本原理：
免疫萤光技术是按照抗体抗原反应的原理，先将已知的抗体或抗原标记上萤光素，制成萤光抗原，再用这些萤光抗原（或抗体）作为探针测量组织或细胞内的相应抗体（或抗原）。在组织或细胞内产生的抗体抗原复合物上富含标记的萤光素，借助萤光显微镜观察标本，萤光素受外来迸发光的照射而发生明亮的萤光（黄红色或橘黄色），可以看到萤光所在的组织细胞，进而确定抗体或抗原的性质、定位，以及借助定量技术测定纯度。
二、应用范围：
其应用范围非常广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗体、肿瘤标志物、血药含量等各类生物活性物质。按照确诊类别，又可分为传染性疾患、内分泌、肿瘤、药物检查、免疫学、血型鉴别等。
三、基本实验步骤：
1、细胞打算。对双层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成双层后取出盖玻片，PBS洗两次；对漂浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心漂洗（,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞活检。
2、固定。按照须要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可放在含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS漂洗3×5min.
3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，通常须要在加入抗原孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗原才能抵达抗体部位。选择通透剂应充分考虑抗体蛋白的性质。通透的时间通常在5-15min.通透后用PBS漂洗3×5min.
4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间通常为30min.
5、一抗结合。温度孵育1h或则4℃过夜。PBST洗涤3次，每次冲洗5min.
6、二抗结合。间接免疫萤光须要使用二抗。温度避光孵育1h.PBST洗涤3次，每次冲洗5min后，再用分馏水洗涤一次。
7、封片及测量。滴加封丸剂一滴，封片，萤光显微镜检测。
四、注意事项：
1、染完以后没有封片前直接照一些，由于有的时侯可能封片会出现问题，再想照反倒没有了，另外不要拖太长时间，萤光会崔灭的。
2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间一直能照出挺好的片子。
3、二抗用之前一定离心，不然有的时侯有那个沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性萤光光点，特别难看。
4、整个操作在4℃下进行，漂洗液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３细胞膜抗原，上述实验条件是避免一抗结合细胞膜抗体后发生交联、脱落。
5、洗涤要充分，以防止游离抗原封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阳性。
6、加适量正常兔血浆可封闭个别细胞表面免疫球蛋白Fc受体，增加和避免非特异性染色。
7、细胞活性要好，否则易发生非特异性萤光染色。抗淬灭剂可用来直接封片,20下挫即可，然后片子可保留更长时间。
五、荧光物质：
1、荧光色素
许多物质都可形成萤光现象，但并非都可用作萤光色素。只有这些能形成显著的萤光并能作为颜料使用的有机化合物能够称为免疫萤光色素或萤光颜料。常用的萤光色素有：
(1)异硫氰酸萤光素（anate，FITC）为红色或橙红色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490--495nm，最大发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄红色萤光，有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的萤光素。其主要优点是：①人眼对黄红色较为敏感，②通常切块标本中的红色萤光多于黑色。
(2)四甲基罗丹明（，）为橘黄色粉末，不溶于水，易溶于酒精和乙酸。性质稳定，可常年保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘黄色萤光。
(3)四苯基异硫氰酸罗丹明（，TRITC）
最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙黄色萤光。与FITC的翠红色萤光对比鲜明细胞膜抗原，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫羰基可与蛋白质结合，但萤光效率较低。
2、其他萤光物质
（1）酶作用后形成萤光的物质个别化合物本身无萤光效应，一旦经酶作用便产生具有强萤光的物质。诸如4-羟基伞酮-β-D半乳香豆素受β-半乳香豆素酶的作用分解成4-羟基伞酮，前者可发出萤光，迸发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如酸性酸酶的底物4-羟基伞酮乙酸盐和辣根二溴化物酶的底物对氨基苯甲酸等。
（2）镧系螯合物个别3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经迸发后也可发射特点性的萤光，其中以Eu3应用最广。Eu3
螯合物的迸发光波长范围宽，发射光波长范围窄，萤光衰变时间长，最适宜用于区分萤光免疫测定。
六、常见萤光素的特点：
1、FITC：白色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄红色萤光。
2、RB200：橘黄色粉末,吸收光570nm，发射光595~600nm，橘黄色萤光。
3、TRITC：紫灰色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙黄色萤光。
4、镧系：Eu、Tb
5、PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，绿色萤光。
6、其它：酶作用后形成萤光物质。