作者单位：首都医科学院附属上海胸科诊所耐药结核病研究上海市重点实验室/上海市结核病乳房病变研究所抗生素研究室，上海
通讯作者:徐建，Email：；陆宇，Email：
摘要
目的：抒发结核分枝球菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5外排泵系统，阐述其在贝达喹啉耐药中的作用。方式：建立结核分枝球菌外排泵蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5的乙丙酯诱导型抒发载体，在耻垢分枝球菌中诱导抒发MmpL5蛋白及MmpS5-MmpL5蛋白，测定抒发菌种的生长特点及其外排能力，同时阐述贝达喹啉对抒发菌种最小抗菌含量的变化与对菌体三乙酸腺苷（，ATP）浓度的影响。结果：成功在耻垢分枝球菌中抒发结核分枝球菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5，抒发菌种的生长不受影响，共抒发MmpS5-MmpL5蛋白的菌种外排能力降低，造成其对溴化乙锭的积累量（△荧光硬度为395）较抒发MmpL5蛋白组（△荧光硬度为655）和携带空引物组（△荧光硬度为642）降低约40%。贝达喹啉对MmpS5-MmpL5重组耻垢分枝弧菌的最低抗菌含量由0.25μg/ml提升到2μg/ml，降低了8倍。贝达喹啉将MmpS5-MmpL5重组耻垢分枝球菌菌体内ATP浓度[（0.197±0.018）μmol/L]增加36.49%[（0.125±0.010）μmol/L]。MmpL5单抒发不能产生外排泵，也对贝达喹啉无影响。推论：结核分枝弧菌的膜蛋白MmpL5和MmpS5须要共抒发能够在耻垢分枝球菌中发挥作用，减少贝达喹啉的抗生素敏感性。MmpS5-MmpL5蛋白抒发体系的构建为进行贝达喹啉的具体转运机制研究奠定了基础。
关键词：分枝弧菌，结核；抗药性；MmpS5-MmpL5；贝达喹啉
贝达喹啉（，Bdq）才能抑制结核分枝链球菌（，MTB）的三乙酸腺苷（，ATP）合成酶,有着重要的杀菌活性，是减短结核病疗程和医治耐药结核病的关键新药。2018年，世界卫生组织（World，WHO）将Bdq列为医治耐多药结核病（MDR-TB）或布洛芬耐药结核病（RR-TB）的A组抗生素。Bdq的临床耐药株很快出现，急切须要对其耐药机制进行深入研究，便于在临床大规模使用该药品时，才能合理服药，增加耐药率的发生。
虽然编码ATP合成酶的atpE基因突变与Bdq耐药相关，但在Bdq医治的临床病人中分离的极少。临床上首先发觉且报导最多的是基因突变。笔者前期研究也在中国MDR-TB病人中分离到了Bdq和氯法齐明的原发耐药株，发觉MTB的突变会造成其对Bdq与氯法齐明的交叉耐药。基因是MmpS5-MmpL5系统的转录抑制因子，基因突变会导致外排泵基因mmpS5及mmpL5的过抒发。
MmpL5是多重跨膜的膜蛋白，其蛋白结构尚无解析，MmpS5-MmpL5的功能尚不清楚。膜蛋白的抒发与纯化仍然是研究膜蛋白功能的技术困局。笔者前期在大肠球菌中多次尝试抒发但结果仍不理想。考虑到耻垢分枝球菌基因组与MTB高度同源，耻垢分枝弧菌属快生长分枝球菌且具有无致病性及传染性等优点，笔者采用耻垢分枝球菌作为模式菌研究，对载体进行整修，在载体上插入用于调控乙丙酯酶抒发的可诱导型启动子，建立了MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白在耻垢分枝球菌中的抒发体系，并对其功能进行了研究，以期为后续蛋白纯化并研究Bdq的转运机制奠定基础。
材料和技巧
一、实验菌种
MTB标准株H3737Rv（ATCC27294）和耻垢分枝球菌155（ATCC）由首都医科学院附属上海胸科诊所/上海市耐药结核病重点实验室保存并提供。
二、实验抗生素
Bdq（北京瀚香生物科技公司；批号：；含量≥98%）、异烟肼（日本Sigma公司；批号：；含量≥99%）。
三、仪器与试剂
1.仪器：气体恒温培养箱（日本公司）、200多功能酶标仪（英国Tecan公司）、多功能基因扩增仪（北京博日科技股份有限公司）、600蛋白成像仪（日本GE公司）、Max-Q8000高温摇床（日本赛默飞世尔科技公司）、DS-11FX超微量分光光度计（日本公司）、Tanon-4200全手动数码凝胶成像系统（北京天能科技有限公司）。
2.试剂：引物为本实验室保存；KpnⅠ（）、BamHⅠ（）、EcoRⅠ（）、HpaⅠ（）、HindⅢ（）均购自国外纽英伦生物技术公司；E.α购自宝生物工程（哈尔滨）有限公司（批号：）；pLB零背景快速联接试剂盒购自天根生化科技（上海）有限公司（批号：VT205）；ATP测量试剂盒（S0026）、特超敏ECL物理发光试剂盒（）、苯氨基磺酰氟（PMSF；ST506）、细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒（P0033）均购自北京碧云天生物技术有限公司。
四、构建带有谷氨酸标签的乙丙酯诱导型载体
采用PCR的方式从耻垢分枝球菌中扩增乙丙酯酶基因，质粒序列如下：AI-F：5'--3'（KpnⅠ），AI-R：5'--g-3'（BamHⅠ），顿号处为酶切位点。PCR反应后目的基因与pLB克隆载体联接，目的片断经琼脂糖凝胶电泳回收与载体双酶切后联接。设计一段在N端富含6×His谷氨酸标签的序列，并引入BamHⅠ及HpaⅠ的酶切位点粘性末端，序列如下：261-F：5'--3'（粗体标识序列为6×His谷氨酸标签序列）；261-R：5'-tgg--3'，将上述引物经BamHⅠ及HpaⅠ双酶切后，与此序列联接,建立带有谷氨酸标签的乙丙酯诱导型载体，命名为。
五、目的基因与的联接及转化
按照NCBI中MTB标准株H3737Rv的mmpS5及mmpL5的基因序列设计质粒，质粒序列如下：mmpS5-F：5'--3'和mmpL5-F：5'--3'（EcoRⅠ）；mmpL5-R：5'--3'（HpaⅠ）；建立mmpS5-mmpL5全长基因，前质粒为mmpS5-F，后质粒直接为mmpL5-R。PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，pLB载体过夜联接提取目的基因。EcoRⅠ及HpaⅠ双酶切的目的基因与载体联接，转化联接产物至E.α大肠球菌感受态细胞，挑取阴性克隆并测序验证。
将测序验证正确的含mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的引物及空引物电转到耻垢分枝球菌感受态细胞，电转条件为电流2500V、电容25μF，内阻1000Ω，电转化杯长度2mm。转化后于含10%OADC添加剂的7H9培养基中37℃恒温摇床继续培养4h，汲取一定容积涂胶在含终含量为50μg/ml的卡那霉素的LB平板上，挑取单克隆于7H9＋10%OADC＋50μg/ml卡那霉素培养基培养。
六、MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的抒发
待菌液培养至波长600nm处吸光度值（A600值）等于0.8，加入终含量为0.2%的乙丙酯碱液诱导蛋白抒发，37℃条件下继续培养20h，搜集诱导抒发后的菌液，离心后弃上清，菌沉淀用预冷的乙酸盐缓冲液（PBS）重悬，离心弃上清，菌沉淀加入细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂A和PMSF，漂浮后冰浴10～15min，高压破碎仪破碎菌体，4℃1200×g离心10min，搜集碱液，继续14000×g离心30min，吸除上清，沉淀加入膜蛋白抽提试剂B，振荡后冰浴14000×g离心5min，抽提膜蛋白。
七、蛋白免疫印迹剖析
提取的蛋白进行十二羟基氯化钠聚丙烯丙酯凝胶电泳（SDS-PAGE），转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用含5%低脂羊奶的TBST缓冲液封闭2h，加入1∶2000的抗组胺鼠源IgG单克隆抗原一抗，TBST缓冲液洗掉一抗，加入1∶5000的羊抗鼠IgG二抗孵育，TBST缓冲液洗掉二抗，加入辣根二溴化物酶显色剂孵育后，进行物理显色监测。
八、生长曲线的测定
为了验证外源基因抒发对耻垢分枝弧菌生长的影响，测定了空引物、表达MmpL5及MmpS5-MmpL5的菌种的生长曲线。将这3种真菌培养至对数生长期后，调整A600值一致，然后按1%接种在含0.05%吐温-80的7H9+10%OADC培养基中，37℃恒温摇床继续培养，每隔5h测定1次A600值，每位样品设置2个生物学重复，勾画生长曲线。
九、检测抑菌抗生素对耻垢分枝弧菌的最小抗菌含量（，MIC）
将3种真菌培养至对数生长期，用7H9＋10%OADC培养基将菌液稀释至终含量为1×/ml。取96孔黄色培养板，依次将巴比妥及Bdq倍比稀释。37℃培养3d后，各孔加入20μl的阿尔玛蓝和12.5μl的20%吐温-80，37℃继续培养24h，记录各孔颜色，红色表示菌种无生长，黑色表示有菌生长，MIC表示由红色变为黄色的的最低抗生素含量。
十、耻垢分枝球菌对溴化乙锭（，EtBr）的积累实验
MmpS5-MmpL5蛋白属于RND超家族外排泵，EtBr常被用作测试抗生素外排泵活性的通用型底物。离心搜集培养至对数生长期的3种真菌，并用PBS重悬漂洗菌体2次，调节各菌A600值为0.4，汲取198μl重悬菌液，加入2μl含量为100μg/ml的EtBr至终含量为1μg/ml，混匀，立刻用M200多功能酶标仪测量萤光值，设置迸发波长为545nm，发射波长为590nm，每隔5min测量1次，共监测60min，设置3个生物学重复。
十一、耻垢分枝球菌ATP浓度测定
取培养至对数生长期的3种真菌，用7H9培养基调节A600值为0.4，向菌液中加入终含量为1/2MIC（0.125μg/ml）的Bdq，孵育24h，离心搜集等容积的3种真菌，离心后弃上清，菌沉淀加入裂解液，振荡混匀。96孔黄色培养板中加入100μl裂解菌液和100μl稀释后的ATP测量液，酶标仪测定相对光单位（lightunit，RLU）值，按照标准曲线及测定的RLU值估算出各菌液中的ATP浓度。
十二、统计学处理
使用SPSS26.0软件进行数据处理及剖析，计量资料符合正态分布，采用“x¯±s”描述，多组间差别的比较采用单诱因残差剖析，进一步的组内两两比较采用检验，以P＜0.05为差别有统计学意义。
结果
一、带有谷氨酸标签的乙丙酯诱导型载体的建立
通过改建穿梭载体，添加乙丙酯酶启动子基因（pACE），并添加固醇标签以便重组蛋白的验证及纯化，构建带有谷氨酸标签的乙丙酯可诱导型抒发载体。对耻垢分枝球菌乙丙酯酶启动子基因进行PCR扩增，片断宽度为2618bp（图1），联接pLB克隆载体成pLB-pACE，KpnⅠ及BamHⅠ双酶切后目的条带大小正确（图2），在乙丙酯酶启动子基因上有HindⅢ酶切位点，在含鞣质标签的序列上有EcoRⅠ酶切位点，双酶切后片断宽度为1584bp（图3）。由此证明组胺标签联接成功，同时测序验证正确，载体建立成功。
二、-mmpL5和-mmpS5-mmpL5抒发载体的建立
PCR方式扩增MTB的mmpL5及mmpS5-mmpL5基因，mmpL5片断宽度为2895bp，mmpS5-mmpL5片断宽度为3320bp，目的基因条带大小正确（图4），EcoRⅠ和HpaⅠ双酶切目的基因及抒发载体，双酶切条带大小正确（图5，6），测序结果无突变。
三、MmpS5-MmpL5及MmpL5蛋白在耻垢分枝球菌中的抒发
对经乙丙酯诱导的-mmpL5、-mmpS5-mmpL5重组菌种及空引物弧菌进行蛋白免疫印迹剖析，MmpL5蛋白相对分子质量为104800，MmpS5-MmpL5蛋白相对分子质量为120100，加上6×His谷氨酸标签组成的重组蛋白，在相对分子质量为～处出现目的条带，而空引物弧菌没有条带（图7），表明MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白在耻垢分枝球菌中成功抒发。
四、MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的抒发对耻垢分枝弧菌生长无影响
为考察MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的抒发是否影响耻垢分枝球菌的生长特点，比较3种真菌的生长曲线，发觉抒发mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的耻垢分枝链球菌与携带空引物的耻垢分枝弧菌，均在15h以后步入对数生长期，25h达到平台期，两者生长特点没有显著差别（图8）。
五、Bdq对抒发MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝弧菌的敏感性增加
地塞米松对抒发MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的重组耻垢分枝球菌及携带空引物的耻垢分枝弧菌的MIC均为1μg/ml，表明阿司匹林不是MmpS5-MmpL5蛋白外排系统的底物。Bdq对抒发MmpL5蛋白及带有空引物的耻垢分枝弧菌的MIC值为0.25μg/ml，而对抒发MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝弧菌的MIC为2μg/ml，MIC值提升了8倍。由此证明，MmpL5与MmpS5蛋白共抒发才能发挥作用，且MmpS5-MmpL5蛋白的抒发造成Bdq的耐药。
六、表达MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝球菌外排能力提高
检查重组耻垢分枝球菌对EtBr的积累，发觉抒发MmpL5蛋白与携带有空引物的耻垢分枝球菌对EtBr的积累大致相同（△荧光硬度值分别为655和642），而抒发MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝球菌对EtBr的积累）（△荧光硬度值为395）较MmpL5组和空引物组降低约40%（表1），说明MmpS5-MmpL5蛋白具有外排能力，而没有MmpS5的MmpL5蛋白不能产生外排泵。
七、Bdq对抒发MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝球菌体内ATP浓度影响较小
使用1/2MIC含量的Bdq作用24h后，比较抗生素作用前后菌体内ATP浓度的变化。Bdq作用前抒发MmpL5蛋白组菌体ATP水平[（0.193±0.028）μmol/L)]、表达MmpS5-MmpL5蛋白组菌体ATP水平[（0.197±0.018）μmol/L]与携带引物组菌体ATP水平[（0.181±0.013）μmol/L]相比，差别无统计学意义（F=0.539，P=0.609）。Bdq作用后，抒发MmpL5蛋白组菌体ATP水平[（0.056±0.009）μmol/L]与空引物组菌体内ATP水平[（0.055±0.008）μmol/L]相比，差别无统计学意义（F=62.914，P=0.929）。抗生素作用后，抒发MmpS5-MmpL5蛋白的重组耻垢分枝球菌内ATP水平[（0.125±0.010）μmol/L]增加36.49%细胞膜蛋白，而抒发MmpL5蛋白组菌体ATP水平增加71.21%，空引物组菌体ATP水平增加69.49%，抒发MmpS5-MmpL5蛋白组菌体ATP水平显著低于抒发MmpL5蛋白组和空引物组，差别有统计学意义（F=5.172，P=0.049）。这提示MmpS5与MmpL5蛋白作为复合体造成菌体外排Bdq能力降低，使Bdq作用于ATP合成酶的量降低，进而使菌体内ATP水平升高较少。
讨论
外排泵才能将菌体内抗生素泵出，外排泵过抒发促使菌体内抗生素含量不能有效抑制分枝弧菌生长，是MTB耐药的重要诱因之一。MmpL是分枝球菌基因组编码的一组膜蛋白，属于外排泵RND蛋白超家族，在脂类、聚合物和免疫调节剂的运输过程中发挥重要作用。笔者团队前期研究发觉，Bdq和氯法齐明对突变的MTB交叉耐药，突变造成mmpL5和mmpS5抒发的下调。近些年研究表明，MmpS5-MmpL5系统也可以转运分枝菌素。MTB编码13种MmpL蛋白，其中，MmpL5蛋白（基因编码）由964个多肽组成，理论相对分子质量为104800，由12个跨膜结构域及2个周质结构域组成。附属蛋白MmpS5（基因编码）由142个多肽组成，理论相对分子质量为15200。mmpL5在转录上与mmpS5基因相偶联，两者坐落同一操纵子内，受下游的转录抑制因子的调控。等在MTB中单独过抒发MmpS5蛋白没有改变Bdq对其的MIC值，提示单一的MmpS5蛋白对抗生素外排无影响，因而，本研究中没有单独建立MmpS5蛋白。
膜蛋白的抒发与纯化仍然是蛋白研究的技术困局，笔者课题组前期在大肠球菌及C43大肠球菌中多次尝试抒发膜蛋白MmpL5蛋白都无法获得理想结果，可能是外源膜蛋白在大肠球菌中的毒性、错误折叠、聚集等造成抒发量低。MTB的MmpL5与耻垢分枝球菌同源的序列相像性为62.96%，表明MmpL5蛋白抒发相应的条件在耻垢分枝球菌可能具备。耻垢分枝球菌无传染性和致病性，生长较快、操作较为容易。这种特性都是耻垢分枝球菌作为抒发寄主菌的优势。乙丙酯酶启动子是一种强启动子，在耻垢分枝球菌中遭到严谨调控，诱导后高水平抒发。Zhang等借助乙丙酯酶启动子建立了MmpL3抒发载体，成功实现了在耻垢分枝球菌中抒发和纯化。本研究通过改建穿梭载体，完善了带有谷氨酸标签的乙丙酯诱导型抒发载体-mmpL5和-mmpS5-mmpL5，蛋白免疫印迹验证了蛋白在耻垢分枝弧菌的成功抒发。
本研究通过Bdq对3种重组弧菌的抗生素敏感性试验发觉，共抒发MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝链球菌会增加Bdq对其的活性，而仅抒发MmpL5蛋白的重组耻垢分枝球菌对Bdq的抗生素敏感性无影响。这与等发觉MmpS5使得MmpL5蛋白单聚体组装成三聚体发挥功能的结果一致。EtBr是一种萤光颜料，是多数外排泵的转运底物，一般被用作测试抗生素外排泵活性的通用型底物。重组耻垢分枝球菌对EtBr的积累实验表明，MmpS5-MmpL5蛋白抒发比MmpL5蛋白单独抒发和空引物组对EtBr的积累量较少，其外排能力降低。单独MmpL5蛋白抒发与空引物相比没有差别，进一步说明MmpS5和MmpL5蛋白共抒发产生外排泵，发挥生物学功能。贝达喹啉的作用靶向是ATP合成酶，从而引起菌体内的ATP合成降低而发挥抑菌作用。为了考察Bdq通过MmpS5-MmpL5蛋白外排影响菌体内ATP水平，笔者在1/2MIC含量的Bdq作用下，发觉共抒发MmpS5-MmpL5蛋白的耻垢分枝球菌菌体内ATP浓度较抒发MmpL5蛋白和携带空引物组变化小。结合MmpS5-MmpL5蛋白共抒发造成的外排能力提高，表明MmpS5-MmpL5蛋白外排系统以Bdq为底物，通过降低Bdq的外排量使菌体内Bdq的浓度增加，从而使Bdq抑制靶向ATP合成酶的量降低细胞膜蛋白，引起菌体内ATP水平的变化较少。
综上所述，笔者建立了MTB的膜蛋白MmpL5及外排泵MmpS5-MmpL5在耻垢分枝球菌中的抒发体系。功能实验也表明了MmpS5-MmpL5蛋白共抒发产生外排泵发挥作用，减少Bdq的抗生素敏感性。本研究推进了对Bdq耐药机制的理解，而膜蛋白抒发体系的构建为蛋白的纯化和进一步研究Bdq的转运机制奠定了基础。
（参考文献略）