DXY网友问：本人核浆分离做了最少两个月了吧，虽然没有哪些进展细胞膜蛋白，我想请问高手赐教一下。我很想晓得我的配方有哪些问题，或则是我的操作有哪些须要注意的地方。非常谢谢！还有，我检查的方式是用Ikb-α（标细胞质）和Oct-1（标细胞核），虽然抗原也不是挺好用。我做的是BT474细胞，cell。
我的方式如下：
1、用A漂洗
2、500G离心5分钟
3、用+B（2：1）裂解细胞，轻轻混匀，孵育5-10分钟
4、离心10分钟（上清：细胞质。沉淀：细胞核和细胞膜）
5、PBD漂洗细胞两次，12000G离心10分钟
6、C裂解细胞膜（装入液氮中快速冷藏，在冰上熔化10分钟）
7、离心10分钟（上清：细胞核。沉淀：细胞膜）
8、用PBS漂洗
9、用PRPA在冰上放置30分钟
10、12000G离心10分钟（上清：细胞膜）
：10mmol/LHepes7.5；10mmol/Lkcl；1.5mmol/LMgcl2；0.5mmol/LDTT；1mmol/LNaF；1mmol/L；1/50ml
：+0.15%ofP-40；
：20mmol/LHepes7.5；420mmol/LNacl；1.5mmol/LMgcl2；0.5mmol/LDTT；1mmol/LNaF；1mmol/L；1/50ml
DXY网友回复：你是不是分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，之后做发觉细胞核中也有Ikb-α，或则细胞浆中也能测量到Oct-1啊？假如是或则细胞膜蛋白，我感觉挺正常的，由于转录因子部份也存在于细胞浆，至于Ikb-α是不是细胞质特异性的我就不清楚了。并且，我认为你用的是试剂盒应当没有问题的，但是也很难彻底分开，在步骤4汲取上清时当心点，不要触碰沉淀，可以剩少许上清（这部份上清不搜集），之后用白尖再把这种上清吸干净丢弃，这样可以尽量降低各个组分的污染。我用过试剂盒分过细胞浆和细胞核蛋白，觉得挺好，起码不影响实验结果。假如，你想精确的彻底的分离，或则想得到Oct-1的话，建议你采用蔗糖梯度离心方式再度富集你搜集的各个组分上清，这可以分离得到比较纯的你想要检查的这些蛋白组分。
楼主问：谢谢赐教，我有如下几个问题，谢谢回答
1、在实验过程中，我搜集上清的时侯的确是搜集一部份，然而剩下的没有弃下，上次改进。
2、对于我的抗原。Ikb-α是多克隆抗原，非特异性很强，觉得非常难做；OCT-1其实是单抗，但我基本上没有检查它应当的大小（90K左右），只是检查到其它的分子量，不清楚为何，大约40多K吧！
3、我想请问您用试剂盒的疗效不影响实验是哪些意思？那那个牌子的试剂盒好用，还有，您检查的方式跟我的抗原一样吗？
4、我的配方上面仍然是加好了DTT的，不现加现用有哪些后果吗？
DXY网友回复：首先我做的抗原跟你不一样，但我可以回答你的问题：
2.我用的大部份抗原多是多克隆抗原，也会有其他非特异性带，而且不论如何目的带总是最显著的，基本上不会影响结果，但是我也发觉不同的来源的细胞用同一种抗原，有的就不会用其他非特异性带，有的不管怎样就会有非特点带，有几个方式可以尽量清除非特点带，抗原的量少加一点，我抗原基本上都是1：1000以上，孵育过夜，二抗的量1：20000（上海中杉），故此可以降低上样量，我通常50-75ug左右，这种前提抗原必须滴度高。
我在抗原上吃过很大的亏，买了两家公司的抗原，都是进口有名的，都没杂下来，后来用了第三家的，就很顺利的做下来了。所以抗原很重要。所以，你首先得排除抗原的问题。我没做过Ikb-α和OCT-1，所以不敢断言你用的OCT抗原有问题，不顾第一次做，通常抗体量加多一定，先保证抗原能杂下来，接出来再做改善。
3.我指的是我用的试剂盒分离细胞浆细胞核组分，那它们去做我的实验包括和EMSA都能检查目的蛋白。至于那个试剂盒好用，就不好说了。我用的是国产碧云天的。
4.通常情况下DTT都是另外配好冻-20度，用时加。但我在配细胞裂解液时就把所有的成份包括DTT配好了，之后分装-20度保存。用时也没发觉有哪些不妥的。所有，我认为应当没有哪些大的影响。
