1)先分离膜,之后提取;如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法促使细胞破碎,之后通过出家离心得到富含膜蛋白的粗组分。(比如:液氮碾磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。搜集37%与41%间的成份,即为质膜部份。裂解即可搜集膜蛋白)
2)用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下,都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶化出来,之后将蛋白质稳定.去垢剂的选择一般是根据他对所须要蛋白质的提取效率来确定,但在个别情况下,还要考虑到之后的纯化步骤.其实许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化,但最终仍可能须要去除去垢剂.这往往会导致蛋白质失活,但若果蛋白质是用于测序的,他将不是一个问题.倘若不是用于测序的,可考虑使用才能粘附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中,都介绍有许多种不同的可拿来溶化膜蛋白的去垢剂.但是,她们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶化方案时,必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如X-100在280nm处有吸收,假若某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关,就应防止使用这类去垢剂.
将膜剂型与胞质蛋白及细胞核分离后,再进一步从细胞膜剂型上将所需的膜蛋白增溶出来.这些做法的用处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白,而无需考虑胞质蛋白、细胞核成份或染色质成份的混进.使用这些方式所获得的膜蛋白,无论在种类上还是数目上,都比酸溶化法所得到的蛋白(
3)膜蛋白色谱(of,CMP)CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混和物的层析系统细胞膜蛋白,通常有去垢剂(如SDS)溶化膜蛋白后产生SDS-融膜蛋白,并由甲基磷灰石为固定相的木柱分离纯化。甲基磷灰石柱具有阴离子乙酸官能团(P-端),又具有阳离子钙(C-端),与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。借助原子散射法研究cAMP的分离机制发觉,样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷多肽与固定相中带电离子间的交换,进而达到分级分离的目的。
4)次序抽提法:按照细胞蛋白溶化性的差别,器具有不同溶化能力的蛋白溶化液进行抽提的方式。用Tris碱碱液裂解细胞提取高溶化性蛋白;把未溶化的用标准液溶化提取高疏水性蛋白;最后用含复合表面活性剂的蛋白溶化液,最后可以再度抽提前两次抽提后不能溶化的膜蛋白。
5)
原理:高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨断裂后,超高速离心
评价:虽然分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,并且可溶性蛋白组分和膜蛋白组分之间依然有不少重复的点.该方式相较MP院士在1998年上发表的分级抽提法除以了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方式。()
6)-based:提取时先裂解液裂胞膜(选用不同的去污试剂是关键)细胞膜蛋白,梯度离心分离细胞器(ER),之后分级抽提方式。诸如,除去细胞器以后的就是核膜,再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部份。
总的体会:细胞的量要很充足。以后的定性鉴别常用的技巧有单向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀丙酯凝胶电泳等。纯化蛋白质含量的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴别膜蛋白,便捷迅速。
到目前为止,提取膜蛋白一直是蛋白学的一个困局。