【技术领域】
[0001]本发明属于生物领域，具体涉及一种快速降低细胞膜私密性的细胞内液及其技巧。
【背景技术】
[0002]全细胞膜片钳技术是用玻璃微电极贴附在细胞表面，施加负压使电极与细胞之间产生高阻封接(即GD级的紧密封接)。在实验中，向玻璃电极内液中加入特定的药物，如两性霉素B，可以使细胞膜穿孔，细胞内液和电极内液连通，这样记录到的玻璃电极内和细胞所处香波之间的电势差即为细胞的膜电位。药物穿孔产生的孔道，分子半径小于0.Snm的离子和分子不能通过，而所有总价离子都可通过，这种孔道没有电流依赖性，同时促使记录过程不受电极钳制电位的影响。
[0003]两性霉素B是一种具有抗菌或灭菌作用的抗霉菌剂。主要是通过作用于细胞膜上的麦角留醇而改变细胞膜私密性。其实全细胞膜片钳技术须要两性霉素B打孔，然而两性霉素B基本不溶于水碱液，易产生固体漂浮颗粒，极易堵塞玻璃微电极尖端；两性霉素B打孔疗效不好，从电极贴附产生高阻封接到细胞破膜常常要30min以上。因而对穿孔膜片钳实验带了一定难度。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的是提供一种快速降低细胞膜私密性的细胞内液。
[0005]本发明的快速降低细胞膜私密性的细胞内液，其特点在于，先将两性霉素B溶化于DMSO中，配制成10mg/mL两性霉素B的DMSO碱液，之后将两性霉素B的DMSO氨水、质量分数0.3%的X-100氨水和常规细胞内液根据容积比50:10:1000的比列混和均匀，由此得到快速降低细胞膜私密性的细胞内液。
[0006]所述的快速降低细胞膜私密性的细胞内液优选通过以下方式制备:
[0007]将每0.0lg的两性霉素B溶化于ImLDMSO,放在涡旋振荡器上以怠速回落2min，混匀后放置在超声仪中以40KHz的频度超声lOmin，最终配制成10mg/mL两性霉素B的DMSO碱液，再按每汲取50μL两性霉素B的DMSO氨水、1yL质量分数0.3%的的X-100碱液溶于ImL的常规细胞内液中，放在涡旋振荡器上回落lmin，之后以40KHz的频度超声lOmin，最后在以的怠速离心30s发觉无漂浮颗粒沉降，由于漂浮颗粒的存在可能堵塞玻璃电极微米级的开口引起电压回路不畅，记录数据不稳定，由此得到快速降低细胞膜私密性的细胞内液。
[0008]所述的常规细胞内液为富含130mM,24mMCsCl,1mMHEPES,,ImMMgCl2，溶剂为水。其配制方式是将上述成份混和均匀杀菌备用。
[0009]本发明的第二个目的是提供一种快速降低细胞膜私密性因而快速破膜产生高阻封接的方式，其特点在于，将含伊维菌素的细胞外液灌入快速投药管中，再将上述快速降低细胞膜私密性的细胞内液灌入微电极中，之后借助含快速降低细胞膜私密性的细胞内液的微电极钳制细胞达到高阻封接后，提起贴壁细胞至快速投药管口，打开快速投药管，使细胞在含伊维菌素的细胞外液中孵育，使细胞在电生理测试状态下Ra值降至10ΜΩ，再停止孵育。
[0010]将伊维菌素溶于常规细胞外液(富含154mMNaCl，1mMD-，1mMHEPES,ImMCaCl2，溶剂为水，其配制方式是将上述成份按其浓度混和均匀即可)中，使伊维菌素的含量为2μΜ，由此得到含伊维菌素的细胞外液。
[0011]两性霉素B对细胞膜私密性的影响具有含量依赖性，怎么最大限度的让两性霉素B溶化于细胞内液的同时结合伊维菌素快速降低细胞膜的私密性，达到最短时间且最佳的穿透疗效借此解决穿孔膜片钳应用的主要问题。本发明解决两性霉素B在细胞内液中的溶化度，借助X-100作为非离子型表面活性剂能促使两性霉素B溶化，使其较好的溶化于细胞内液中，在整个实验过程中两性霉素B处于水溶化状态，同时结合伊维菌素降低细胞膜通透特点，实验开始前孵育细胞辅助两性霉素B—起在短时间内破膜，在此含量下的X-100碱液可以破坏细胞膜上的脂类在细胞膜表面打孔，促使细胞膜穿孔产生，且对细胞无毒副作用，不影响细胞的状态。破膜后停止抚育，同时在两性霉素B的帮助下稳定细胞膜处于稳定通透状态，进而使细胞还能在l_2h内处于稳定的电压记录状态。
[0012]为此本发明的快速降低细胞膜私密性的细胞内液，并结合伊维菌素快速降低细胞膜私密性因而在膜片钳实验中快速破膜产生高阻封接进行实验。
【具体施行方法】
[0013]以下施行例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0014]施行例1:
[0015]将0.0lg的两性霉素B溶化于ImLDMS0，放在涡旋振荡器上以高速回落2min，混匀后放置在超声仪中以40KHz的频度超声lOmin细胞膜片，最终配制成10mg/mL两性霉素B的DMSO氨水。汲取50μL两性霉素B的DMSO氨水、10μL质量分数0.3%的X-100氨水(将0.3g的X-100溶于10ml的水底，得到质量分数0.3%的X-100碱液)溶于ImL细胞内液(富含130mM,24mMCsCl,1mMHEPES,ImMCaCl2,ImMMgCl2,溶剂为水)中，放在涡旋振荡器上高速回落lmin，之后以40KHz的频度超声lOmin，最后再以的怠速离心30s发觉无漂浮颗粒沉降，由此得到快速降低细胞膜私密性的细胞内液。
[0016]之后将伊维菌素溶于常规细胞外液(富含154mMNaCl,1mMD-,,ImMCaCl2，溶剂为水)中，使伊维菌素的含量为2μM，由此得到含伊维菌素的细胞外液。
[0017]将1ml本施行例的含伊维菌素的细胞外液灌入快速投药管中，再将本施行例的快速降低细胞膜私密性的细胞内液灌入微电极中，之后借助含快速降低细胞膜私密性的细胞内液的微电极钳制细胞达到高阻封接后，提起贴壁细胞至快速投药管口(含伊维菌素的细胞外液的投药管口)，打开快速投药管。细胞在含伊维菌素的细胞外液中孵育2min后细胞在电生理测试状态下Ra值降至10MΩ，停止孵育。依此方式得到的细胞可以在2min内快速溶化细胞膜，同时电极内部的两性霉素B继续与细胞膜中的麦角留醇互相作用维持细胞膜常年处于稳定的通透状态，可以在l_2h内记录到稳定的电压结果，不会由于细胞膜在记录过程中反复的闭合导致记录中断，而且在此过程中对细胞的状态无影响，无毒副作用。
【主权项】
1.一种快速降低细胞膜私密性的细胞内液，其特点在于，其是先将两性霉素B溶化于DMSO中，配制成10mg/mL两性霉素B的DMSO碱液，之后将两性霉素B的DMSO氨水、质量分数0.3%的X-100氨水和常规细胞内液根据容积比50:10:1000的比列混和均匀，由此得到快速降低细胞膜私密性的细胞内液。2.按照权力要求1所述的细胞内液，其特点在于细胞膜片，所述的快速降低细胞膜私密性的细胞内液是通过以下方式制备:将每0.0lg的两性霉素B溶化于ImLDMSO,放在涡旋振荡器上以怠速回落2min，混匀后放置在超声仪中以40KHz的频度超声lOmin，最终配制成10mg/mL两性霉素B的DMSO碱液，再按每汲取50μL两性霉素B的DMSO氨水、10μL质量分数0.3%的的-100碱液溶于ImL的常规细胞内液中，放在涡旋振荡器上回落lmin，之后以40KHz的频度超声lOmin，最后在以的怠速离心30s发觉无漂浮颗粒沉降，由此得到快速降低细胞膜私密性的细胞内液。3.按照权力要求1所述的细胞内液，其特点在于，所述的常规细胞内液为富含,24mMCsCl,1mMHEPES,ImMCaCl2,ImMMgCl2，溶剂为水。4.一种快速降低细胞膜私密性因而快速破膜产生高阻封接的方式，其特点在于，将含伊维菌素的细胞外液灌入快速投药管中，再将权力要求1所述的快速降低细胞膜私密性的细胞内液灌入微电极中，之后借助含快速降低细胞膜私密性的细胞内液的微电极钳制细胞达到高阻封接后，提起贴壁细胞至快速投药管口，打开快速投药管，使细胞在含伊维菌素的细胞外液中孵育，使细胞在电生理测试状态下Ra值降至10ΜΩ左右，再停止孵育。5.按照权力要求4所述的方式，其特点在于，所述的含伊维菌素的细胞外液，其制备方式是将伊维菌素溶于常规细胞外液中，使伊维菌素的含量为2μΜ，由此得到含伊维菌素的细胞外液。6.按照权力要求5所述的方式，其特点在于，所述的常规细胞外液富含,1mMD-，1mMHEPES,ImMCaCl2，溶剂为水。
【专利摘要】本发明公开了一种快速降低细胞膜私密性的细胞内液及其方式。先将两性霉素B溶化于DMSO中，配制成10mg/mL两性霉素B的DMSO碱液，之后将两性霉素B的DMSO碱液、质量分数0.3％的X-100碱液和常规细胞内液根据容积比50：10：1000的比列混和均匀，由此得到快速降低细胞膜私密性的细胞内液。本发明的快速降低细胞膜私密性的细胞内液，并结合伊维菌素快速降低细胞膜私密性因而在膜片钳实验中快速破膜产生高阻封接进行实验。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】
【申请号】CN2
【发明人】李志远,精湛,刘静馨
【申请人】中国科大学上海生物医药与健康研究院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月27日