生理药动学模型结合全细胞膜片钳技术评价胺碘酮和去甲基胺碘酮的体外肾脏安全性
来源
《中国医药》
2022年7月第17卷第7期
作者
杜海燕,李静,张颖超,赵玉林,刘之光,郭成军,苏俊武,林阳
首都医科学院附属上海东直门诊所药事部
首都医科学院附属上海东直门诊所心外科
首都医科学院附属上海东直门诊所小儿肾脏中心
摘要
目的:通过生理药动学(PBPK)模型结合全细胞膜片钳技术研究胺碘酮及其活性代谢产物去甲基胺碘酮对心肌细胞hERG通道和动作电位的影响,评价其体外肾脏安全性｡
方式:基于复合PBPK模型预测胺碘酮､去甲基胺碘酮在人体心肌药动学曲线｡选用模型预测的胺碘酮､去甲基胺碘酮含量(预测胺碘酮血清含量0.76mg/L,心肌含量17mg/L)､预测去甲基胺碘酮血清含量0.13mg/L,心肌含量8.5､17mg/L)分别灌流细胞(hERG)､人干细胞诱导分化心肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录并观察抗生素对外向钾流､心肌细胞动作电位的影响｡
结果:PBPK模型预测胺碘酮心肌含量约为血清含量的23倍,而去甲基胺碘酮心肌含量是血清的约130倍｡静脉滴注或口服多次给药后胺碘酮的血清､心肌含量均基本保持恒定,而去甲基胺碘酮的血清､心肌含量均呈持续下降,去除平缓,易积聚｡胺碘酮和去甲基胺碘酮均对hERG通道有较强的抑制作用,并呈含量依赖性;胺碘酮在血清含量､心肌含量下,对hERG通道的抑制率分别为78.9%和95.8%,去甲基胺碘酮在血清含量､心肌含量下(0.13､8.5､17mg/L)对hERG通道的抑制率分别为28.3%､87.4%和96.7%｡胺碘酮､去甲基胺碘酮在血清含量下对心肌细胞动作电位的影响不明显,但在心肌含量下对动作电位幅度､动作电位时程､静息电位均有较强的抑制作用,并使动作电位领取频度推进,且呈现含量依赖性｡
推论:临床常用剂量下,分布在心肌的胺碘酮､去甲基胺碘酮对钾离子流､心肌动作电位均有显著的抑制作用｡这些抑制作用可能对心率失常的心肌在一定程度上有益,但可能具有一定的安全性风险,非常是去甲基胺碘酮在心肌组织的积聚效应｡
关键词
生理药动学模型;全细胞膜片钳;胺碘酮;去甲基胺碘酮;肾脏安全性
正文
胺碘酮是以Ⅲ类抗心率失常作用为主的多离子通道阻滞剂,兼顾Ⅰ､Ⅱ､Ⅳ类抗心率失常抗生素的电生理作用｡手册及循证医学证据显示,胺碘酮是目前临床应用最广泛的低毒抗心率失常药[1-3]｡但同时,肾脏不良风波也是胺碘酮的主要不良反应之一[4],主要表现为心动过缓/QT间期延长｡胺碘酮药动学特点复杂,个体差别较大,且抗生素血清含量与效果和毒副反应并不呈反比,其代谢产物去甲基胺碘酮亦具有较强的电生理特点[5-6]｡临床实践中使用差别很大,欠缺药动学指导下的规范化使用[7]｡我们基于以前构建的胺碘酮､去甲基胺碘酮复合生理药动学(PBPK)模型[8],结合全细胞膜片钳技术,预测胺碘酮､去甲基胺碘酮在心肌组织的分布曲线,进一步评估抗生素体外肾脏安全性,为临床安全使用胺碘酮提供根据｡
材料与技巧
1.1材料
细胞系:稳定抒发hERG钾通道的细胞系(美国公司);人干细胞诱导分化心肌细胞及相应心肌细胞培养基(北京柏寿生物技术有限公司)｡试剂:胺碘酮注射液(商品名:可达龙,诺华安万特上海药业有限公司);去甲基胺碘酮(日本Inc.)｡仪器:EPC-10放大器系统(日本HEKA公司)｡
1.2方式
1.2.1胺碘酮PBPK模型预测抗生素肾脏组织分布
借助原本构建的胺碘酮､去甲基胺碘酮复合PBPK模型[8],模拟临床常规静脉滴注多次给药后[第1天:首剂负荷静脉注射150mg/10min(3ml),此后滴注360mg/6h,剩余18h滴注540mg(0.5mg/min);第2~4天:维持滴注720mg/24h],胺碘酮和去甲基胺碘酮的心肌抗生素含量-时间曲线;模拟临床常规多次口服给药后(首剂800mg/d,此后200mg/8h,连续给药4d),胺碘酮和去甲基胺碘酮的心肌抗生素含量-时间曲线｡
1.2.2实验设计和细胞膜片钳检查
按照胺碘酮PBPK模型模拟静脉多次给药血清､心肌含量分组:胺碘酮组(模型预测血清含量0.76mg/L,心肌含量17mg/L)､去甲基胺碘酮组(模型预测血清含量0.13mg/L,心肌含量8.5mg/L､17mg/L)､空白溶剂对照组｡
细胞膜片钳检查方式参照文献[9]｡将3×103个细胞铺到盖玻片上,置24孔板中培养,18h左右后,细胞密度≤80%｡在倒置显微镜(中国Motic公司AE3131E型)下操纵微电极操纵仪(日本MCI公司型)将记录电极接触到细胞上,采用全细胞记录模式｡记录并观察内向钾流[hERG(IKr)]､干细胞诱导心肌细胞动作电位｡待讯号稳定后,依次灌流给与不同含量的抗生素,观察动作电位参数的变化,记录期间独立重复测量｡所有电生理实验均在温度下进行｡当形成全细胞封接后,转为电压钳模式,细胞膜电压钳制于0pA,连续记录心肌细胞自发动作电位｡实验数据由EPC-10放大器(日本HEKA公司)进行采集并存储于软件(日本HEKA公司)中｡
1.3统计学剖析
采用SAS8.0统计软件处理数据｡给药前后动作电位参数变化采用随机区组残差剖析检验｡P<0.05为差别有统计学意义｡
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结果
2.1胺碘酮PBPK模型预测抗生素心肌组织分布
借助PBPK模型分别预测多次静脉滴注､口服给药后,胺碘酮和去甲基胺碘酮在肾脏的组织分布见图1｡
结果显示:①模型预测胺碘酮心肌含量约为血清中的23倍,而去甲基胺碘酮心肌含量是血清的约130倍;②胺碘酮多次静脉滴注给药后,胺碘酮和去甲基胺碘酮在血清､心肌组织中含量均持续下降,呈积聚的状态｡非常是去甲基胺碘酮,给药期间含量快速下降,给药停止16d后药时曲线仍缓慢,去除特别平缓｡胺碘酮心肌含量范围17.0~26.7mg/L,去甲基胺碘酮心肌含量为17~40mg/L;③胺碘酮多次口服给药后,胺碘酮在血清､心肌含量基本能保持恒定,心肌含量范围8~14mg/L;去甲基胺碘酮在血清及心肌中明显积聚,多次给药后心肌峰含量持续下降至54.35mg/L｡
2.2胺碘酮､去甲基胺碘酮体外心肌安全性评价
我们采用了实测血清平均含量(胺碘酮0.76mg/L,去甲基胺碘酮0.13mg/L)和较低的心肌含量(胺碘酮心肌含量17mg/L,去甲基胺碘酮心肌含量17mg/L,因作用太强,又加测减半含量8.5mg/L)进行体外膜片钳实验｡借助膜片钳技术检查了在PBPK模型预测的含量范围内,胺碘酮及其活性代谢产物去甲基胺碘酮对hERG钾离子通道的作用,以及对干细胞诱导心肌细胞动作电位的影响｡结果显示,胺碘酮在血清含量､心肌含量下,对hERG通道的抑制率分别为78.9%和95.8%,去甲基胺碘酮在血清含量､心肌含量下(0.13､8.5､17mg/L)对hERG通道的抑制率分别为28.3%､87.4%和96.7%,与含量呈正相关｡胺碘酮､去甲基胺碘酮对干细胞诱导心肌细胞动作电位的影响:与空白溶剂对照组比较,血清含量下,胺碘酮､去甲基胺碘酮对动作电位的影响不明显,但在心肌含量下可明显抑制动作电位幅度､动作电位时程､静息电位,使动作电位领取频度推进,并呈现含量依赖性｡胺碘酮组17mg/L时,去甲基胺碘酮组17mg/L时以上各指标及去甲基胺碘酮组8.5mg/L时动作电位领取频度与空白溶剂对照组比较差别均有统计学意义(均P<0.05)｡见图2｡
讨论
胺碘酮作为目前临床上应用广泛的抗心率失常药,已被证明是维持心房颤动病人窦性心率的有效抗生素｡但是,也有研究报导其具有延长QT间期､致扭转型室性心动过速等的致心率失常作用,胺碘酮的使用与较高的死亡率以及肾脏功能增加状态之间存在关联[10]｡且这些潜在的风险未能预测｡
胺碘酮及其活性代谢产物去甲基胺碘酮都有较高的脂胺类,易在心､肺､肝､脂肪等组织积聚,这种组织中的抗生素含量远小于血清含量,易造成心､肺､肝等脏器的功能异常｡往年药动学研究多关注抗生素在血液循环的曝露量,并且常年服食胺碘酮病人实测值显示心肌组织抗生素含量与血清含量相关性很差[6],血药含量检测尚不能挺好地指导临床安全服药｡
我们以前构建并验证了胺碘酮､去甲基胺碘酮的复合PBPK模型[8],并分别预测静脉滴注､口服给药后胺碘酮､去甲基胺碘酮在组织脏器中的抗生素分布特点｡其中,胺碘酮心肌含量约为血清含量的23倍,而去甲基胺碘酮心肌含量是血清的约130倍,与之前报导的病人实测值相像[6]｡我们同时预测到静脉滴注､口服多次给药后胺碘酮的血清､心肌含量均基本保持恒定,而去甲基胺碘酮的血清､心肌含量均呈持续下降｡文献报导去甲基胺碘酮在胰脏生成后步入胃液,随胃液排入肝脏,存在柔肠循环[11],故其血清和组织含量随医治时间的延长而减小,我们的预测结果与之一致｡预测给药停止16d后,去甲基胺碘酮代谢清除平缓,心肌含量仍较高,须要非常注意｡
本研究结果显示,胺碘酮及去甲基胺碘酮在血清､心肌含量下对hERG通道具有显著抑制作用,并呈含量依赖性｡同时,在心肌含量下,胺碘酮及去甲基胺碘酮均使心肌细胞静息电位下降(绝对值增加),动作电位驱动力减小,幅度显著增加,似有致心肌QT间期减短的效应｡提示胺碘酮及其活性代谢产物去甲基胺碘酮的致心率失常效应似乎与其含量相关,鉴于我们所选择心肌含量是心肌血药含量-时间曲线中较低的含量点,目前临床常用给药方案下,预测胺碘酮及其活性代谢产物去甲基胺碘酮的综合肾脏安全风险相对较大｡具体作用机制尚需进一步研究阐述｡有研究报导QT间期减短致降低心率失常和心源性身亡风险[12],提示该药的肾脏安全风险不容忽略｡
其实,我们建立的PBPK模型显示,常规给药剂量时,胺碘酮､去甲基胺碘酮的心肌含量远远低于血清含量｡体外研究显示,上述抗生素在血清含量下对钾离子流有显著的抑制作用,心肌含量下药物对钾离子流及心肌动作电位的抑制作用大大提高,肾脏安全风险显著下降｡非常是活性代谢产物去甲基胺碘酮对各项电生理指标的抑制作用均不高于母药胺碘酮,随着给药次数的降低,其心肌含量持续积聚,肾脏安全风险存在下降趋势｡提示我们可能须要适当增加胺碘酮的临床给药剂量｡临床研究结果显示,心率失常病人坚持常年小剂量服食胺碘酮医治有效率达93.02%,且安全可靠[13]｡最新循证研究更倾向于100~200mg/d低剂量给药[14]｡
假如通过PBPK模型调整病人维持剂量,使抗生素在心肌的含量保持在恒定安全含量区域,或有助于临床愈发安全有效地使用胺碘酮,尚须要进一步的临床研究验证｡
参考文献
详见《中国医药》2022年7月第17卷第7期