【摘要】：目的：胃癌卡介苗(tumor)是指给机体直接或间接输入的具有抗体性的成份，它可剌激机体免疫系统形成抗肺癌免疫效应，用于医治肝病。病变细胞的抗体(，Ag)绝大部份为细胞膜蛋白。搜集其进行研究，对于找寻高效病变抗体具有重要意义。本研究采用改良的法和强碱洗脱法搜集不同分子量的人食道癌细胞株Eca-109细胞膜蛋白，找寻能导致免疫反应的癌症抗体，筛选出高效癌症抗体的大致范围，为食道癌的免疫医治提供根据。方式：1．提取Eca-109细胞膜蛋白：使用改良的法先提取细胞膜。之后在pH6.3的条件下，用去垢剂()Ⅹ-100和辛基β-葡糖甙(octylβ-)，把细胞膜上的蛋白溶化出来，以超滤法纯化膜蛋白并分组。2．以超滤法纯化膜蛋白并分组：以超滤法将膜蛋白从以Ⅹ-100作去垢剂的成份中按分子量大小分出＜3KD、3～10KD、＜10KD、10～30KD四个组；从以辛基β-葡糖甙做去垢剂的成份中分离出30～100KD、＞100KD两个组，并测定各组膜蛋白含量。3．测定膜蛋白的含量：用测量法，在pH6.3、波长595nm处，制做蛋白标准曲线，测定富含去垢剂的各组膜蛋白含量，推导入适当的去垢剂与膜蛋白之比(即mg去垢剂／mg膜蛋白)。
4．检查Eca-109细胞的HLA表型及筛选健康志愿者：使用HLA质粒试剂盒，琼脂糖凝胶电泳(gel)观察聚合酶链反应(，PCR)扩增后的DNA产物，鉴别出Eca-109细胞的HLA表型。采用血浆学HLA分型技术细胞膜抗原，找寻起码有一个HLAⅠ类基因位点与Eca-109细胞HLA相匹配的健康志愿者。5．人外周血DC的培养：取筛选出的志愿者的外周血，密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(bloodcells，PBMC)，用含粒细胞-巨噬新乡学院2004年博士学位论文人胆管癌Eca一109细胞膜病变杭原筛选的研究细胞集落剌激因子(一macro坤昭eeolo妙飞，GM一CSF)、白细胞介素一4(一4，IL一4)及该志愿者血浆的即Ml1640培养液调整细胞密度后，加入24孔板中培养。于培养的第4天，按照一定比列加入膜蛋白，第6天加入LPS促使DC成熟，于第7天收获成熟的漂浮DC。
冷藏保存抗体负载的成熟DC:富含10%DMSO和5%蓝莓糖的纯自身血浆作为冻存液，可以将密度为10xl护/ml抗体负载的成熟DC，以每分钟降温1℃，放置于液氮的液相中保存。6.人外周血T细胞的培养:在IL一2维持下，流式细胞仪测量此志愿者PBMC的分化情况。依据测量结果，再收获PBMC，经过换培养瓶及PHA剌激，以含hIL一2的RPMI1640培养液常规培养PBMC4周，搜集纯化的T细胞。7.MTT法测定致畸T细胞的细胞毒活性:以纯化的T细胞为效应细胞，加入抗体负载的成熟DC，以8:l、16:l、32:l的效靶比分别加入Eea.109细胞(其为靶细胞);同时设阴性对照组、阴性对照组及效应对照组，各组设3个复孔，用MTT法在%孔板中测定CTL的细胞毒活性。8.强酸洗脱法:双层生长的Eca一109细胞每晚按如下方式处理:除去培养液，PBS洗三次，每斤加5ml构椽酸一乙酸盐缓冲液(pH3.3)温度作用lmin，使MHC分子变性，释放MHC分子结合的肤入碱液。病变细胞经PBS洗3次，用培养液继续培养。每斤细胞最多酸洗3次弃去。富含肤的酸洗液经过seP一PakC18柱脱盐、真空浓缩和YM·3()超过滤，一ZooC冻存。
9.反相高效气相(RP一HPLC)剖析:Eca一109细胞细胞膜酸洗肤用HPLC分离，流速lml/min，用O%~70%梯度(v八护)0.085%TEA的乙睛氨水(B液)洗脱，水相为含0.085%TFA的水氨水。自动搜集各峰，脱盐、浓缩和干燥，一20℃冻存。10.病变特异性细胞毒性〔CTL)T淋巴细胞的体外诱导:取该志愿者负载不同组分抗体肤的DC作为剌激细胞，在剌激细胞培养孔中加入自身外周血淋巴细胞，于24h后，再加入等容积的含ZOU/mlth一IL一2继续培养，每3天换液1次。每7天应用剌激细胞重复剌激淋巴细胞1次，共培养21天。11.”c:释放试验检查cTL杀伤活性:Eca一109细胞为靶细胞，在4xl护细胞中加入100pCiNa25’CrO;，在温度中放置lh，不时摇晃。用大量HankS液充分漂洗细胞3次，去除游离铬，配成5x10勺m1病变细胞悬液。细胞以50:1效靶细胞比加入96孔U一底培养板(200pl/孔)培养4h。每位样品设置3个复孔，搜集培养上清，用Y计数仪测量上清CPM值。富含淋巴细胞、不负载抗体DC和靶细胞的孔为对照孔。结果:广州学院2004年博士学位论文人食道癌Eca一109细胞膜病变抗体筛选的研究1.在pH6.3的条件下，适当的去垢剂与膜蛋白之比(即mg去垢剂/mg膜蛋白)，在使用辛基p一葡糖昔时为6:1;使用肠妞。
nX一100时为2:1。2.Eea-log细胞的HLA的基因分型为A，03，A细胞膜抗原，24;B，35，B，37;n盼l’01，DRBI’12;DRB3。并找到一例表型为A03杂合子的健康志愿者。3.PBMC的分化情况:健康人PBMC，只在IL一2维持下，用流式细胞仪测量其分化情况。B细胞于第1周时基本死亡，第3周时完全消失;NK细胞于第1周时显著降低，于第4周时