《生命的物理》2009年29卷3期·490·●OFLIFE2009，29(3)文章编号:1000-1336(2009)04-0490-05细胞冷藏冰晶损伤和应激损伤机理袁晓华(成都血液中心，成都)摘要：高温下保存生物材料可使临床研究不受限于时间空间，安全有效的细胞冻存可以为组织工程、基因医治和细胞移植提供丰富的细胞来源。冷藏保存早已成功应用于许多细胞株系，但不同来源的细胞系冻存效率差距很大，仍有细胞系在提升高温冻存效率时面临困局未能突破。细胞冷藏损伤机理在冰晶损伤和细胞应激损伤方面还有待更深入的了解，本文将集中讨论近些年来这方面的一些研究进展。关键词：冷藏损伤；胞内冰晶；间隙联接；调亡；热激蛋白中图分类号：Q65/Q813自从1949年Polge等意外发觉甘油对家畜精液身不是绝对有害的，它取决于那些冰晶是否会在复[1]的冷藏保护作用以来，人们仍然在探求细胞冷藏损温过程以微小冰晶为核，发生再结晶。近些年Acker[2-5]伤的机制，希望才能从中找寻一些复杂细胞组织未等对细胞冷藏过程中胞内外冰晶的产生机制作了能实现高温冻存的缘由并开发新的途径。
通常觉得一系列的研究，提出了无害胞内冰[2]在降温和升温过程中细胞内外水份的结晶程度和温ice)。她们比较了单个培养和双层度变化速度达到最佳平衡是至关重要的，通过对不培养细胞冷藏时的胞内冰晶对细胞复苏率的影响，同来源的细胞采取不同的冷藏保护剂配方，调节降觉得对于单个细胞，胞内冰的成核生长对细胞有害，温升温速度，最大限度地防止冰晶的生长和细胞体但对于以双层细胞方式冷藏来说，胞内冰沿细胞间积过度变化，使许多株系的细胞得到成功冻存。但隙在相邻细胞的扩散是无害的，甚至部份胞内冰的还有许多细胞株在提升冷藏保存效率时面临困局无产生避开了细胞过度脱水和容积骤起对细胞膜、细法突破，这彰显了细胞对冷藏损伤反应的种属特异胞器导致的损害，具有冷藏保护作用。而胞外冰晶性，“耐冻”与“不耐冻”细胞株之间的区别在那里？的产生也不是绝对无害的，如人胚胎干细胞以保湿本文综述了近些年来细胞冷藏损伤机理研究方面的一的细胞团方式冷藏保存，胞外冰晶的产生会破坏细[8]些进展。胞的间隙联接，导致细胞岛团松散，复苏率极低。1.细胞冻存中的冰晶损伤总的来说，细胞以单个细胞悬液、单层细胞还是以Mazur的“两诱因假说”将细胞冷藏损伤归结于多层细胞团方式冻存会导致冰晶的生长模式的不[6]“溶质损伤”和“胞内冰损伤”两大诱因，人们也是同；冰晶的产生不是绝对有害的，细胞冷藏降温从尽量避开此两种伤害来设计机油成份及降温速过程中产生的胞内冰晶是否会对细胞导致致命损伤率来冻存细胞。
但细胞冻存过程中细胞内外冰晶的取决于冰晶的数目、大小、形成位置以及复温条件。产生机制以及其对细胞导致致命损伤的机制有待更2.细胞间隙联接对冷藏损伤的作用深入的研究。在细胞降温过程中微小冰晶的产生本细胞间隙联接(gap)是存在于大多数植物组织细胞之间或细胞与细胞外基质之间的一种联接结构。体外培养的喂奶植物细胞在冷藏保存时，如收稿日期：2009-02-23果以单细胞悬液的方式进行保存，细胞在加入防寒作者简介：袁晓华(1980-)，女，硕士，联系作者，E-mail:@液后与之接触充分，使火花塞的渗透才能较完全，《生命的物理》2009年29卷4期●新进展·491·OFLIFE2009，29(4)细胞复苏率较高。但对于有些细胞，如人和灵长类DMSO、甘油、乙二醇等等来防止冰晶损伤，另外通的胚胎干细胞株系，细胞以岛团状形式生长，细胞过添加膜稳定剂如海藻糖，多肽等和生物抗氧化[18]之间存在间隙联接，紧密的细胞联接和细胞旁分泌剂来缓解渗透性损伤稳定细胞结构，这种方式均因子对维持其体外未分化生长至关重要，所以细胞能明显改善细胞回产率。
但细胞冷藏损伤还包括氧冻存时必须以含100~200个以上细胞的结节方式进化应激反应，自由基释放，Na/K-ATP酶抑制造成离[9,20]行的。这样影响了细胞与机油的接触，此时细子内环境衰弱等，这种风波会成为细胞在防止机械胞间隙联接的存在对冰晶生长的影响可能是导致其损伤后复苏培养后的一段时间内仍发生自噬的剌激[10]冷藏保存效率低下的缘由，这对皮肤等组织的冷藏诱因细胞膜损伤，导致冻存细胞存在生存极限(cap)，保存研究也具有重要意义。即改进了机油配方和降温速度后细胞始终未能提复杂细胞组织冷藏时，胞内冰在细胞层内随机高复苏率。近些年来，研究者对其发生机制和解决方产生，之后向相邻细胞间扩散，使胞内冰的产生机案进行了探求。[4]率大大降低，其扩散方向不是随机的(如图1所示)，细胞自噬是一个复杂的病理生理过程，包括细这一现象广泛存在于复杂细胞组织冷藏中。后来的胞外途径和细胞内途径：细胞外途径即细胞膜死亡研究表明，细胞之间的接触和胞内冰的产生有密切受体(如Fas、TNFR、TRAIL)与官能团结合后启动FADD[1]关系。等总结了细胞内外冰晶生长扩散模式途径，由-8介导小游讯号传导；细胞内途径的两种说法：一种是表面推动成核说(-cata-即在各类应激反应下线粒体跨膜势能增长，细胞色lyzed,SCN)，觉得是细胞膜与胞外冰晶接素C释放，由-9介导下游讯号传导。
这两条触，成为胞内冰的成核位点，这一理论解释了细胞途径均激活胱天蛋白酶()级联反应，造成细外冰晶对胞内冰成核的影响；另一说法觉得胞内冰胞发生自噬。在对外周血单核细胞冷藏损伤中的凋晶是通过相邻细胞膜上的间隙联接向周围生长扩散。亡风波研究中觉得，细胞冻融过程中发生的自噬是[12]近些年的实验表明，间隙联接的确在冰晶扩散生长中通过线粒体介导的，依赖胱天蛋白酶途径执行的。[4]发挥作用，但是具有体温依赖性。最初冰晶在细冻存后复苏的狗肾MDCK细胞-3的浓度比未胞层中随机出现后，有间隙联接存在的细胞，其相冻存的细胞平均降低了3.5倍，复苏后6~21小时检邻细胞急剧出现冰晶的机率大大降低，而没有间隙测到其抒发量达到高峰，在此后的培养36小时后恢[7][10]联接的细胞，就无此状况。而组织脏器的冷藏保复到冻存前的浓度，与V/PI联染法测量存中冰晶成核与细胞间隙联接的情况则更为复杂，到的细胞复苏后自噬高峰的时间一致。在冻存过程这也是其成功冻存无法成功的缘由。中或复苏培养后添加胱天蛋白酶抑制因子如zVAD-3.细胞自噬与冷藏损伤的关系fmk，抑制细胞自噬胱天蛋白酶介导的讯号通路才能传统细胞冻存方式通过添加渗透性防寒剂如[10,12]改善细胞冻存复苏后的生存率。
胱天蛋白酶抑图1冰晶在细胞内的扩散模式图[4][4]冰晶首先在细胞内随机产生，其后的扩散不是随机的。《生命的物理》2009年29卷3期·492·●OFLIFE2009，29(3)剂型zVAD-fmk才能改善多种细胞冻存后的生存率。胞，在卵母细胞的冷藏保存中，25℃低温环境会使[11]Boon等在对人胚胎干细胞完整集落慢速冷藏的研细胞膜发生相变，反应和HSP抒发降低，细胞通过[17]究中发觉，引起其极低复苏率的缘由是大量的细胞细胞外途径走上自噬导致冻存效率的增长。在复苏培养的一段时间内发生大量自噬。在人精液通过对转录水平mRNA的研究表明，高温下细[14]冻融过程中，也存在-9被激活引起自噬的现胞过度抒发的应激蛋白包括热激蛋白和冷激蛋白，[13]象。胱天蛋白酶抑制剂zVAD-fmk可以作为一种新在不同来源的细胞中抒发发挥不同的作用，显然这型防寒剂用于敏感细胞的冷藏保存。是不同来源的细胞在对冷藏损伤作出不同的应激反4.细胞应激蛋白与冷藏损伤应，表现为“耐冻”或“不耐冻”的缘由之一。热正如本文之前所提及的，细胞在冻融过程发生激蛋白(heatshock,HSP)是细胞对逆境作出坏死或自噬是其对种种不利条件作出的应激反应。
自我保护时须要的细胞内分子伴侣蛋白，在所有类而在极端严寒条件下生存的生物如极地鳗鲡，个别型细胞中组成性抒发并高度保守，对细胞内一些蛋动物、植物体显存在天然的抗寒机制，在冰点以下白质分子构型和和稳定性的调节，细胞应激、代谢、温度时可以通过耐冻()或避冻(增殖以及自噬等生理过程均具有重要的调控作[22][15])机制来防止冰晶损伤。将其中对生物体用。HSP除了可由热应激诱导形成，也参与冷应起冷藏保护作用的物质加以提取细胞膜损伤，可以得到天然的激反应。高温下细胞HSP的抒发量有被诱导下调，但防寒剂，作为新型防寒剂在高温保存方面具有一定[14,16,17]也有被抑制抒发的，与细胞在高温下经历的的优势，其来源的开拓、作用机理的探求和生产技一系列损伤风波有关，其具体机制还需进一步的研术的提升成为冷藏保护剂研究和开发的新方向。究。冷激蛋白是因细胞在低从冬眠植物在冬眠周期前通过身体对高温环境温环境下应激抒发而命名的一类蛋白，其结构保守的一系列适应性反应来防止高温的伤害中得到启性高于HSP。高温下细胞的蛋白合成和代谢水平都[14]发，在对细胞进行冻存之前，先让细胞接触高于处于抑制状态，可溶氧的浓度降低，高温下合成37℃生理体温的高温环境(25℃)，诱导细胞对高温的CSP的细胞应激反应通路被觉得与缺氧反应时一致。
适应性反应，待热激蛋白的过抒发(其中研究最多的CSP与高温下细胞蛋白合成抑制有关，其中被广泛是HSP70)然后再进行冻融，可作为改进复苏效率的报导的Cirp和Rbm3在转录和翻译水平调节高温下[16,19][14]新途径之一。但这一途径并不适用于所有的细细胞的蛋白合成。图2总结了细胞冷藏保存损伤图2细胞冷藏保存损伤《生命的物理》2009年29卷4期●新进展·493·OFLIFE2009，29(4)的几个方面。,5.小结2001,10:561-571[11]BoonCHetal在1950年细胞成功地实现冷藏保存以来，许多种冻存方式被应用于不同来源的细胞上，而且人们发觉，细胞实现成功地冷藏保存并不像最初构想的than.JSci,那样简单，初期细胞冷藏的研究在很大程度上是经445[12]Setal验性的，实际工作中许多细胞在冻存方式的改进上+CD4面临困局，细胞存活率难以取得更大的提升，但是细胞冷藏保存的经验在复杂脏器组织上的应用并不,2003,47:44-58成功。
细胞冷藏保存在人类辅助生殖中的广泛应用[13]Uetal使细胞冷藏损伤的反应机制和其对胚胎后续发育的Bio,[21]影响深受关注。人们对植物细胞的基础高温生物2004,71:1828-1837学特点及冷藏机理仍须要进一步的了解。随着上述[14]Betal问题的解决，植物细胞冷藏保存的理论和实践将得到进一步发展。.J,2006,397:247-259[15]ASetal参考文献&,2004,101:227-257[1]Aetal.and.AnnNYAcad[16]DBetalSci,2005,1066:119-inhuman.J,1993,[2]AckerJPetal.ofice(2):196-.,2003,46:197-202[17]AravAetal[3]AckerJPetal.Celltocellofin?MolCell,2008,after.,2000,40:54-63282(1-2):150-152[4]AckerJPetal.ice:[18]KEetforicepores.,2001,81:1389-..,2008,90(1):186-193[5]AckerJPetal.Pre-andpost-thawof[19]Metalice.J,2004,215:131-138[6]Detal.oficeinSci,2008,ofcells.,J(3-4):182-,88:647-660[20]LiXetal[7]AJetal.ofcells.,2003,46:194-,2008,17(6):1079-1085[8]BoonCHetal.Theofhuman[21]Aetcells.Appl,2005,41:97-.AnnN.Y.AcadSci[9]SunKOetal.forofhuman[22]stemcells.StemCells,2005,23:605-.AnnuRev,2001,63:327-357[10]BaustJMetal.Abasisof《生命的物理》2009年29卷3期·494·●OFLIFE2009，29(3)Theofincells:aof-(Blood,,China)tionisinfortheofcellsin;newarethatmakeuseofcellsasthebasisfor.,gene,larallrelyontheabilitytostoreandtransportcellsandtissuesinordertobesu.Thofcellsandforlongpoftimebythemhasledtoainhowandarewhentheyaretocoldtemper.Therearemanyaspectstothetocellsonthatarestill.Inthisbriefwewillofinjurytheaspectsofinjuryduringeservationthatarestill.Keyury;ice;gapj;;heatshock
