本发明属于细胞膜联通号剖析技术领域，具体涉及一种微囊泡诱导细胞膜电位变化的无损检查方式。
背景技术：
生物膜中脂类排列成双分子层，在膜中每位类脂分子均可纵向运动，也可以发生转动和联接的活动，致使生物膜具有柔硬度、流动性、高内阻性以及对高分子的不透过性。固醇包括乙酸甘油酯(即磷脂)、鞘脂质和甾体，这种成份的有序排列及互相作用，产生了细胞膜特定的结构与生物功能。脂类均由一疏水部份和极性端基构成，磷脂或乙酸酯的极性端基间常能产生构象，大多数脂类的疏水部份为两个脂肪族双链。生物膜表面带电主要诱因是组成生物膜的磷脂或生物大分子)带有带电侧链（如氨基酸链的甲基末端和羟基末端）；导致生物膜内两侧的电荷不致具有一定的电位。
膜电位对细胞的生长、增殖以及酶活性等至关重要，造成细胞生长和分化异常、细胞功能衰弱。一些具有带电性的蛋白质甚至dna链也会在膜上的特定微区-“脂筏”。脂筏组装体是鞘磷脂紧密有序的排列，鞘磷脂所含长链饱和脂肪链，相变气温差，脂肪链流动性差，造成混和膜发生相分离。以脂单层分子的疏水端为界细胞膜电位，生物膜可分为近胞质面和非胞质面内外两层，使生物膜具有不对称性。同时膜脂、膜蛋白和复合糖在膜上均呈不对称分布，造成膜具有不对称性和方向性，进而使膜内外两层的流动性不同，使物质传递有一定方向，讯号的接受和传递也有一定的方向性。
生物亲脂性的颜料分子在膜的取向，显示膜周围的化学和物理性质。偶极是一个内部潜在生物膜膜脂类和水份子的界面的因为非随机生成和电偶极的取向。按照细胞膜的成份不同，偶极在为200-范围中，偶极可能影响膜蛋白和氨基酸等na+/k+和离子通道。
细胞膜内外具有不同的电位，常用膜边镊来测定细胞膜的电极电位，此方式对显微观察设备、实验操作精确度要求比较高，主要采用探针尖端刺入被测细胞中，同时容易对细胞导致损伤。探针di-8-稳定萤光发光官能团坐落膜表面距离中心近200um,电荷转移萤光波谱变化与萤光探针di-8-电场硬度相关，通过外加电场的改变来调控细胞膜的膜电位响应情况，结合双波长萤光百分比估算方式，用萤光探针标记细胞膜测定膜电位的变化细胞膜电位，借助电场造成di-8-改变萤光硬度。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种微囊泡诱导细胞膜电位变化的无损测量的技术方案。该方式通过采用膜电位敏感萤光探针di-8-标记细胞膜，采用微囊泡诱导细胞膜电位变化，通过萤光硬度的强弱反映了细胞膜电位的变化，且不影响细胞寿命。
所述的一种微囊泡诱导细胞膜电位变化的无损检查方式，其特点在于包括以下步骤：
（1）以di-8-为萤光颜料标记细胞膜；
（2）通过脉冲发生器调节电场变化，使细胞萤光硬度与外加电场成线性相关；
（3）通过微囊泡诱导细胞膜电位变化；
（4）测定di-8-标记细胞膜的萤光硬度变化，并通过细胞萤光硬度与外加电场之间的线性多项式，得到细胞膜在微囊泡诱导下电位变化。
所述的一种微囊泡诱导细胞膜电位变化的无损检查方式，其特点在于所述的步骤（2）中外加电场硬度为100-500mv。
所述的一种微囊泡诱导细胞膜电位变化的无损检查方式，其特点在于所述的步骤（3）中微囊泡为脂肪酸和乙酸自组装产生的微囊泡。
上述的一种微囊泡诱导细胞膜电位变化的无损检查方式，设计合理，与现有技术相比具有以下有益疗效：
1、本发明提供了一种以本发明通过萤光显微镜观察di-8-标记的细胞膜萤光硬度的变化，可以有效、连续测定细胞的膜电位变化。
2、本发明最大的特征在于对被测细胞没有损伤，实现无损、精确检测，快捷、动态地反应出细胞膜随环境变化导致的膜电位极化变化趋势，可以有效反映出微囊泡与细胞互相作用导致细胞结构与生理变化。
3、本发明借助自组装产生微囊泡诱导细胞膜电位变化。
4、本发明为在静电引力、范德华力和官能团作用，造成细胞表面电荷密度的改变，诱导膜中蛋白质等其他分子的构型变化导致膜电位变化的无损检查提供有效方式。
附图说明
图1为进行微囊泡诱导细胞膜电位无损检查方式的装置图；
图2为施行例2中萤光硬度与细胞膜电位之间的关系图；
图3为施行例3中萤光中度与外加电场成线性相关图；
图4为施行例4中不同链长不同含量脂肪酸对iec-6细胞膜电位萤光硬度影响图；
图5为施行例5中不同链长乙酸（cn=6，7，8）对iec-6细胞膜电位萤光硬度影响图。
具体施行方法
以下结合施行例来进一步说明本发明。
施行例1：一种微囊泡诱导细胞膜电位无损检查方式，包括以下步骤：
（1）以di-8-为萤光颜料标记细胞膜；
（2）通过脉冲发生器调节电场变化（100-500mv），使细胞萤光硬度与外加电场成线性相关；
（3）通过微囊泡（脂肪酸和乙酸自组装产生的微囊泡，如链长为c4-c9的脂肪酸，链长为c4-c8的乙酸）诱导细胞膜电位变化；
（4）测定di-8-标记细胞膜的萤光硬度变化，并通过细胞萤光硬度与外加电场之间的线性多项式，得到细胞膜在微囊泡诱导下电位变化。
本发明用到的试验装置如图1所示，包括了pc、外加电场装置、显微镜等。
施行例2
采用膜电位颜料di-8-测定iec-6膜电位的变化，di-8-是一种对膜电位高度敏感的染色剂，能特异性地分布在细胞膜表面，使细胞膜呈现萤光，电位的高低将变化di-8-的萤光硬度分布含量。电位高，di-8-萤光显色为黄色或桔黄色；反之则为白色，萤光硬度之比增加则意味着iec-6细胞膜电位的增加，如图2所示。
施行例3
经过di-8-膜萤光颜料标记的iec-6细胞，在外加电场作用（100-500mv）对iec-6细胞表鼻贴电位的影响，采用leica倒置萤光显微镜进行成像观察，leica剖析软件采用剖析图象，获得iec-6细胞表鼻贴电位定量曲线；从iec-6细胞表鼻贴电位的变化来看，iec-6细胞表鼻贴电位与外加电场成线性相关，随着外加电场的不断降低，iec-6细胞表鼻贴萤光硬度不断减少，如图3所示。
施行例4
因为不同链长脂肪酸会产生自组装，脂肪酸亲水头基的电荷作用将改变iec-6细胞膜偶极，导致膜电位的变化。通过对不同脂肪酸在不同含量值对iec-6细胞膜电位变化的影响，测得萤光波谱数据，不同链长脂肪酸不同含量造成膜颜料萤光硬度的变化，反应了细胞膜电位的变化，如图4所示。
施行例5
因为不同链长乙酸会产生自组装，乙酸亲水头基的电荷作用将改变iec-6细胞膜偶极，导致膜电位的变化。通过对不同链长乙酸对iec-6细胞膜电位变化的影响，测得萤光波谱数据，不同链长乙酸造成膜颜料萤光硬度的变化，反应了细胞膜电位的变化，如图5所示。
技术特点：
技术总结
一种微囊泡诱导细胞膜电位变化的无损检查方式，属于细胞膜联通号剖析技术领域。其包括以下步骤：以Di‑8‑为萤光颜料标记细胞膜；通过脉冲发生器调节电场变化，使细胞萤光硬度与外加电场成线性相关；通过微囊泡诱导细胞膜电位变化；测定Di‑8‑标记细胞膜的萤光硬度变化，并通过细胞萤光硬度与外加电场之间的线性多项式，得到细胞膜在微囊泡诱导下电位变化。该方式通过采用膜电位敏感萤光探针Di‑8‑标记细胞膜，采用微囊泡诱导细胞膜电位变化，通过萤光硬度的强弱反映了细胞膜电位的变化，且不影响细胞寿命。
技术研制人员：陈丽春;邓少平
受保护的技术使用者：山东科技大学
技术研制日：2017.04.27
技术公布日：2017.09.26