通信作者：郑浩院士（中国海洋学院），邢松江院长（英国麻省学院）
通信单位：中国海洋学院，英国麻省学院
论文DOI：10.1021/.
FrontCover
图片摘要
成果简介
日前，中国海洋学院郑浩院长课题组与日本麻省学院阿默斯特学校邢松江院士在ACSAu上发表了题为“ofacidsonof--genesgenus”的研究论文（DOI：10.1021/.），并成功入围第3卷第2期封面文章。本研究针对多功能底泥改良剂木醋液（acids，PA）缩减底泥ARGs污染过程中怎样影响抗性基因水平转移（HGT）这一关键科学问题，否认了PA对RP4引物介导的多重耐药基因在大肠球菌HB101和之间的接合转移具有效应（即低剂量推动但高剂量抑制），阐明了高剂量的PA因为其抗菌性抑制了RP4引物接合转移的发生，而低剂量的PA通过诱导细胞内活性氧的形成、促进细胞膜私密性及降低细胞间接触，促使了RP4引物的接合转移。研究结果为基于PA的底泥ARG污染阻控技术的完善提供了新的科学看法，同时指出了底泥改良剂施用不当时推动ARGs传播扩散的潜在风险。
序言
药物滥用引起的真菌耐药性已成为21世纪恐吓人类健康和生态环境安全的重大挑战。粪肥施用、污水灌溉、污泥浇水和垃圾填埋等人类活动造成大量的药物抗性基因（genes，ARGs）步入底泥，致使农业底泥成为ARGs的重要存储库。富集于底泥中的ARGs可通过食物链步入人体，进一步激化药物耐药性对人类健康的恐吓。因而，有效缩减底泥ARGs污染对减轻药物耐药性在全球范围内传播并保障全球生态系统健康具有重要意义。生物质热解产物木醋液（acids，PA）作为一种多功能底泥改良剂，可增加底泥盐分和pH，调节真菌群落，灭活动物病原菌，促使小麦生长并提升粮食产值。课题组前期研究发觉，无论是PA单独施用，还是与生物炭联合施用，均可通过抑制基因水平转移（HGT）、降低重金属共选择压力、调节微生物群落等途径有效减少底泥ARGs产率，且PA对HGT的抑制是ARGs降低的主要诱因。但是，PA对HGT过程的影响机制尚不明晰，限制了基于PA的底泥ARG污染修补技术的发展。本研究以携带RP4抗性引物的大肠球菌HB101为供体菌、大肠球菌为受体菌建立接合转移模型，以废弃木材为原料于450°C下热解制备木醋液面膜（PA）为代表，借助平板计数法评估了PA对RP4引物介导的ARGs在大肠球菌种内接合转移影响的剂量效应关系（图1）。为进一步明晰PA的关键成份及pH对PA影响ARGs接合转移的作用，选择98、130和220°C下PA的三种分馏组分（F1、F2和F3）以及磷酸、2-甲氧基乙醇、2,6-二甲氧基酚和3-氨基-1,2-环戊二酮四种关键代表性成份，并通过调节接合体系的pH，探究了其对ARGs接合转移的影响（图1）。最后，通过探究真菌活性、ROS形成、细胞膜透性、表面形貌、胞外聚合物（EPS）分泌及表面电荷变化，阐明了PA调控ARGs接合转移的分子机制（图1）。本研究将为基于PA的底泥ARG污染阻控技术的完善提供新的科学看法。
图1.本研究实验设计示意图
图文导读
PA对RP4引物在大肠球菌间的接合转移具有效应
（a）接合子数目；（b）接合转移频度；（c）受体菌数目；（d）供体菌数目
图2.不同剂量的木醋液PA对RP4引物在大肠球菌间接合转移的影响
为评估PA对RP4引物介导的ARGs接合转移的剂量效应关系，借助平板计数法测定了接合子数目和接合转移频度（图2）。与对照组相比，较高剂量的PA（40~100μL）使接合子数目明显减少了74~85%（图2a），抑制了RP4引物的接合转移。但是，60~100μL的剂量下接合转移频度却较空白对照明显增强了30~45%（图2b）。这主要归因于PA造成受体真菌数目降低（86~90%）的程度小于接合子（78~85%）(图2a，c)。但是，较低剂量（10和20μL）的PA使接合子数目和接合转移频度明显降低了26~47%和114~234%（图2a，b），显著推动了RP4引物的接合转移。这种结果否认了PA对ARGs在真菌种属内的接合转移具有效应，即低剂量推动但高剂量抑制。
PA的关键组分对接合转移的影响
（a）接合子数目；（b）接合转移频度；（c）受体菌数目；（d）供体菌数目
图3.PA及其一种分馏组分对RP4引物在大肠球菌间接合转移的影响
为明晰PA的物理组分对PA影响RP4引物接合转移的作用，首先探究了PA的三种分馏组分（F1、F2和F3）对ARGs接合转移的影响（图3）。与PA相像，三种分馏组分对RP4引物接合转移也表现出了类似的效应（图3a，b）。尤其是较高剂量的F3（40μL）使接合子数目降低了49%，而较低剂量（10和20μL）下接合子数目降低了25~63%。另外，PA及其组分对接合转移作用的效应程度PA>F3≈F2>F1（图3）。这种结果与课题组前期的研究结果一致，即PA及其分馏组分有效减少了底泥中ARGs的产率，这进一步否认了PA通过抑制HGT过程来缩减底泥ARGs污染的可行性。
（a,b）磷酸；（c,d）磷酸、2-甲氧基乙醇；（e,f）2,6-二甲氧基酚；（g,h）3-氨基-1,2-环戊二酮
图4.PA的四种关键成份对接合子数目和RP4引物在大肠球菌间接合转移频度的影响
PA及分馏组分具有不同浓度的酸类、酚类和硫醇等物理物质，这可能造成其对接合转移的影响程度不同。为进一步明晰PA中影响ARGs接合转移的具体组分，按照其物理组成，探究了磷酸、2-甲氧基酚、2,6-二甲氧基乙烷和3-氨基-1,2-环戊二酮四种具有抑菌和抗氧化性能的代表性组分对RP4接合转移的影响（图4）。与PA及其一种分馏组分相像，和对照组相比，PA的四种关键成份在亚抑制含量下（即丙酮和2-甲氧基苯胺含量为0.001mg/mL，2,6-二甲氧基乙烷含量为0.1mg/mL，3-羟基-1,2-环戊二酮为0.05mg/mL）分别使接合子数目降低了39%、49%、12%和24%（图4），促使程度为磷酸≈2-甲氧基酚>2,6-二甲氧基乙烷≈3-羟基-1,2-环戊二酮。相反地，当这四种物质的含量低于MIC时（即丙酮含量为0.1mg/mL，2-甲氧基苯胺含量为1mg/mL，2,6-二甲氧基乙烷含量为2mg/mL，3-羟基-1,2-环戊二酮为3mg/mL），接合子数目均明显降低，且增加程度为磷酸≈2,6-二甲氧基乙烷>3-羟基-1,2-环戊二酮>2-甲氧基乙醇（图4）。可见，PA的这四种关键成份对RP4引物接合转移也具有与PA相像的效应，这就否认了PA中的酸类、酚类和盐类等化合物是其造成ARGs接合转移剂量效应的关键诱因。
碱性PA增加了接合体系的pH因而抑制了RP4引物在大肠球菌间的接合转移
（a，b）高剂量PA曝露下的接合子数目和接合转移频度；（c，d）低剂量PA曝露下的接合子数目和接合转移频度
图5.PA碱性对RP4引物在大肠球菌间接合转移的影响
ARGs接合转移过程对外界环境条件（如pH、温度、湿度和酸度等）非常敏感。PA中的磷酸和2-甲氧基乙醇等碱性成份使PA的pH常常呈碱性（≤2.81），这造成PA添加下的接合体系呈碱性（pH5.45~6.75）。为探究PA的pH对RP4引物接合转移的影响，本研究进一步设置了空白组（CK，不添加PA且不调节pH）、pH对照组（pH，添加PA且不调节pH）、pH调节组（，添加PA且将接合体系pH调为7.0）与无PA处理组（noPA，不添加PA并将接合体系pH调节为与添加PA时一致），进行了同样的接合转移实验。结果表明，添加较高剂量（40μL）的PA或分馏组分时，与pH对照组（pH5.45~6.45）相比，pH调节组的接合子数目和接合转移频度明显降低；与空白组相比，无PA组（pH5.45~6.45）的接合子数目和接合转移频度分别增长了30~52%和12~39%（图5a，b)。这说明高剂量的碱性PA增加了接合体系的pH值，继而抑制了RP4引物的接合转移。另外，添加较低剂量（20μL）的PA或分馏组分时，无PA组（pH6.07~6.75）的接合子数目和接合转移频度与空白组相比，分别增加了32~66%和10~67%（图5c，d），这说明低剂量的PA增加了接合体系的pH，也是抑制ARGs接合转移的主要诱因。综上所述，这种结果证明了无论高剂量或低剂量的碱性PA所造成的接合体系pH的增加，均抑制了RP4引物在大肠球菌间的接合转移。
值得注意的是，虽然pH调节组的与空白组的pH均为7.0，但高剂量PA下pH调节组的接合子数目仍高于空白组（图5a，b），低剂量PA下pH调节组的接合子数目仍低于空白组（图5c，d）。据悉，无PA组的pH值调节至与pH对照组相同后，高剂量下无PA组的接合子数目更高（图5a细胞膜透性，b），低剂量下无PA组的接合子数目更低（图5c，d）。这种结果进一步表明了不仅PA造成的接合体系pH增加外，PA的关键组分也是影响接合的重要诱因。往年研究发觉多种有毒有机化合物（如麦草畏、对羟基丙酮和乙酸）在高于MIC水平下，可通过降低胞内ROS、细胞膜透性和细胞间的接触推动ARGs接合转移，而低于MIC水平的这种化合物则可通过抗菌作用抑制ARGs的接合转移。为此，我们推论同样具有抗菌作用且富含大量酚类的PA对RP4引物的接合转移也可能有相像作用机制，这种机制将在下边进一步讨论。
PA推动了真菌胞内ROS形成、细胞膜透性和真菌间接触
（a）ROS形成；（b）GSH添加对接合转移的影响；（c）TEM图象；（d）腐细胞膜透性；（e）PN/PS及真菌表面Zeta电位
图6.PA及其分馏组分对真菌胞内ROS形成、细胞膜透性及真菌间接触的影响
外界环境胁迫诱导真菌细胞形成的活性氧（•O2–、•OH和H2O2）可剌激氧化应激，破坏生物分子（如DNA、膜蛋白和脂类），激活SOS反应，甚至引起细胞死亡，因而影响ARGs接合转移。PA及其分馏组分造成供受体大肠球菌胞内ROS水平呈剂量依赖性降低，且降低程度次序为PA>F3>F2>F1（图6a），这与它们对接合转移的推动或抑制作用基本一致（图3a，b）。低剂量的PA及其组分通过推动胞内ROS的形成，诱导氧化应激和SOS应答细胞膜透性，促使了RP4引物在大肠球菌间的接合转移。虽然PA及其组分在高剂量时比低剂量诱导的ROS水平更高（图6a），但因为过低水平的ROS常常造成真菌细胞死亡（图3c，d），因而抑制了RP4引物的接合转移。为了进一步确定所观察到的ROS降低是否与属内接合转移有关，探究了ROS清理剂芦丁（GSH）的添加对接合转移的影响。结果表明，相对于不添加GSH组，添加GSH组的接合转移频度与不添加PA的空白对照组相比无明显差别（图6b），否认了PA及其组分诱导的ROS形成是其推动接合转移的关键诱因。
真菌细胞膜是制止胞外物理物质和基因自由步入细胞的重要屏障。ROS可与细胞膜上的不饱和脂肪酸发生反应，导致脂类二溴化，造成细胞膜私密性提高。通过TEM图象观察，未处理组大肠球菌胞结构正常，细胞膜完整，表面光滑，胞浆致密，细胞分散，化学接触有限（图6c）。但是，低剂量（10和20μL）PA处理组中，细胞细胞膜显著损伤，造成膜孔形成，细胞边界模糊，菌毛破裂，细胞与细胞之间的接触提高（图6c），这种现象均有利于ARGs接合的发生。借助流式细胞仪进一步定量了PA对大肠球菌细胞膜私密性的影响（图6d），发觉细胞膜私密性随PA及其分馏组分剂量的降低而降低，且促使程度为PA>F3>F2>F1（图6d），与推动接合转移的作用相一致（图3a，b），否认了低剂量PA通过降低细胞膜透性促使了ARGs接合转移。但是，高剂量PA使病菌细胞完全灭活，细胞膜完全断裂，这也是TEM图中细胞膜损伤更严重、细胞质萎缩或漏水的缘由，进一步表明了高剂量PA造成细胞膜严重损坏使病菌失活，因而抑制了ARGs接合转移（图6c）。
有效的细胞间接触是ARGs接合转移成功的关键。EPS主要由蛋白质、多糖、胞外DNA和固醇组成，其通过推动细胞间接触在生物膜产生和真菌基因转移中发挥重要作用。EPS的形成受ROS的讯号调节。PA及其组分一方面降低了EPS中蛋白质与黄酮（PN/PS）的比列，提高了细胞表面疏水性，另一方面增加了真菌表面负电荷，减小了真菌细胞间的静电作用力，更有利于病菌间的接触，为RP4引物的传播提供了便利（图6e）。据悉，相关剖析结果表明，真菌胞内ROS形成、细胞膜透性及EPS的形成均与PA的乙醇，2-甲氧基乙醇，2，6-二甲氧基乙烷和3-氨基-1，2-环戊二酮四种关键成份浓度呈正相关，进一步否认了PA中的酸类、酚类和硫醇等代表性的物理组分诱导的非致死胁迫效应是其推动ARGs接合转移的主要诱因。
‘’
小结
该工作首次评估了多功能底泥改良剂PA对真菌属内引物介导的多重耐药基因接合转移的效应（低剂量推动但高剂量抑制），并从分子水平上明晰了PA调控ARGs接合转移的机制。较高剂量（40~100μL）的PA抑制RP4引物在大肠链球菌属内接合的主要诱因是：（1）受体和供体生长遭到抑制；（2）抗氧化系统的破坏；（3）细胞膜破损；（4）菌毛破裂（图7）。这些抑制作用主要是因为PA的抑菌成份（磷酸、2-甲氧基乙醇、2,6-二甲氧基乙烷和3-氨基-1,2-环戊二酮）以及PA的碱性（pH≤2.81）共同造成。较低剂量（10~20μL）的PA促使接合的主要诱因包括：（1）胞内ROS生成降低；（2）细胞膜私密性提高；（3）EPS浓度降低；（4）真菌表面电荷降低（图7）。这些推动作用主要归因于PA的关键物理成份诱导的真菌非致死胁迫效应。该研究为基于PA的底泥ARG污染阻控技术的完善提供了新的科学看法，并为底泥改良剂PA的合理施用提供了着力证据。基于PA对ARGs接合转移的效应，本研究结果指出了优化底泥改良剂施用剂量以通过抑制ARGs的水平转移缩减底泥ARGs污染的必要性。据悉，PA低剂量下对ARGs接合转移的推动作用也引起了人们对PA和其他具有抑菌活性的底泥改良剂（如腐殖酸和木制素）不当施用而通过提高水平基因转移推动底泥中ARGs传播扩散的环境风险的忧虑。
鉴于PA的代表性组分（如酸类、酚类和硫醇）对接合转移具有关键作用，未来可通过选择合适的原料和分馏工艺优化PA的抗菌性能，以提升PA对底泥ARGs污染的修补疗效。据悉，我们发觉PA在低剂量下通过降低ROS的形成、细胞膜透性和EPS的生产促使了ARGs接合转移，因而PA与一些抗氧化剂（如芦丁和硫尿）或EPS清理剂（如金属基纳米材料和群感讯号分子抑制酶）联用可能有助于克服PA施加量不当时引起的ARGs传播风险。但是，本研究仅选用了一种木材废弃物制备的PA，且借助实验室纯菌培养模型来探究其对大肠球菌种内真菌间ARGs接合转移的影响，但PA的原料和多元化的制备工艺常常造成其组成和性质差别较大，其对ARGs的接合转移或其他水平转移过程（如转化和转导）的影响，尤其是实际底泥生态系统的微生物群落之间ARGs水平转移的影响可能也存在较大差别，未来仍值得进一步探究。
该项研究得到了ofSanyaBayandCity()，Keyand()，China()，FundYoungof()项目的捐助。
‘’
作者简介