【研究背景】
自然界的蛋白质通道在细胞膜上进行分子转运，一般具有极高的选择性。一个明显的事例是水通道蛋白家族，它以每秒109个分子的速率输运水分子，同时敌视离子和质子。其它知名的事例包括K+/Na+选择性为1万倍的钾离子通道KcsA以及质子的选择性为其它总价阳离子105倍以上的质子通道M2。这种天然通道系统作为仿生物理领域灵感的来源，也对人工通道跨膜传输性能设定了极高的标准，对人工通道系统来说无疑是极具挑战性的。事实上，虽然人工通道在过去四六年中取得了巨大的发展，迄今为止只有一种人工通道系统才能在功能上真正模仿了天然通道系统，即近来报导的人工水通道，其在保持对盐和质子的高敌视性的同时，在水输运速度方面超过了水通道蛋白细胞膜水通道，为其输运速度的2.5倍（Nat..2021,16,911）。近些年来，人工质子通道也取得了一些重大进展，对Cl-、Na+和K+的选择性倍数分别可达到167.6、122.7和81.5，而质子输运速度高达自然界最快的质子通道短球菌肽的1.22倍。不仅这种为数不多的通道系统外，科研人员努力开发仿生高选择性离子通道用于选择性输运K+、Na+、Cl-、ClO4-或I-的人工通道，但并没有取得更大的成功。值得一提的是，虽然目前没有钠离子选择性通道可以在单通道电压实验的证明基础上实现赶超10倍的Na+/K+选择性，但人工钾离子通道早已有了明显的进展，其K+/Na+选择性从2017年的9.8，2020年的14.0和16.3，2021年的18.2以及2023年的20.1。但是，与天然钾离子通道KcsA小于1万倍的K+/Na+离子选择性相比，这种相对较小的数字的确表明人工钾离子通道系统还有巨大的发展空间。
龙岩学院曾华强院长课题组提供了一种新颖的基于空间位阻的策略，在提升人工钾离子通道的钾/钠离子输运选择性到创纪录的20.1的同时提升了离子输运活性。相关成果近来发表在Lett上，Doi:10.1016/let.2023.。硕士研究生马浩文为文章的第一作者，曾华强院长为通信作者。
【图文简介】
基于之前的工作，课题组早已证明分子5F8是一个优良的K+选择性通道（图1a），通过单通道传导实验确定了其K+/Na+选择性为9.8。在(Fmoc-Phe-C4)n的一维晶体结构中，其链间的距离值为5.0Å，这与利使劲场估算得出的(5F8)n中的链宽度离为4.9Å较为一致。但该值显著大于C5中15-冠-5官能团在B3LYP/6-31G*基组下估算得到的分子长度（6.0Å，图1b)，这说明(5F8)n中的冠醚在自组装的过程中并不是以最稳定的构型堆叠产生。换句话说，(5F8)n中的冠醚与C5中的冠醚存在一定程度的构型区别。对此作者提出了将两种空间上互相兼容的大分子络合物(苯并冠醚和叔丁基)通过共价键联接到可将这种大分子络合物一维排列在构象结构的同右边的单肽骨架上的策略。因为官能团的作用，同类型的大分子络合物(无论是苯冠醚还是叔丁基)之间存在强烈的空间敌视力，因此有利于产生异质聚合体。在这种异质聚合体中，空间相容的苯冠醚和叔丁基官能团在一维结构的同两侧呈互相交替的排列，而不是只有单一类型的苯并冠醚或叔丁基的同质聚合体。自组装的同质聚合体(5F8)n通过社会自排序过程发生结构转变，产生异质聚合体结构(5F10•BF10)n。图1d是通道分子库的设计，通过组合物理筛选可以与BF8配对形成具有提高离子转运活性和选择性的异质聚合体的分子。
图1.(a)同质自组装结构（5F8）n可能通过社会自选择过程经历结构转变产生异质自组装构结构（5F8‧BF8）。(b)通过估算得到的Boc中的叔丁基，C5中的15-冠-5和C6中的18-冠-6的分子长度。(c)通过估算获得的在(5F8‧BF8)n结构中，5F8中的15-冠-5和BF8中的叔丁基在空间上具近乎完美的兼容性。(d)通过组合物理优化可与BF8配对以形成具有提高离子传输活性和选择性的异质组装体的分子的分子设计。
离子输运活性的测试采用包含萤光颜料HPTS的LUV囊泡实验进行。结果表明，对富含C8H17或官能团的8个K+选择性通道，采用该空间位阻策略能使所有通道的钾离子转运活性明显提升68%至230%（图2b,c），非常是对苯丙谷氨酸基通道，其K+/Na+选择性也得到了明显的提升（图2d）。在此轮筛选中，通道(5F10•BF10)n在离子转运活性和选择性方面均为最佳（图2d,e）。
Fig.2.(a)用于评估离子通道离子传输特点、基于HPTS的LUV囊泡实验。（b）1.8mmol/L含量下细胞膜水通道，在富含5F10、BF10和MF10的异质和同质组装体中观察到的典型K+输运曲线。(c)异质组装体((nFm‧BFm)n和(nFm‧MFm)n)以及同质组装体((nFm)n,(BFm)n和(MFm)n(n=5,6,m=8,10)相对的钾离子输运活性(RK+)。(d,e)(nXm‧BXm)n和(nXm)n（n=5,6,m=8,10,X=F,L,V,I或A）相对的钾离子输运活性(RK+和EC50)。HPTS=8--1,3,6-acid。
进一步采用同样的方式进行甲基基团的筛选。我们发觉，羧基的微小变化会极大地提升其K+/Na+选择性，由此筛选出性能优异的异质聚合体(5F12•BF12)n（图3a）。随即发觉摩尔比对离子选择性也形成影响（图3b），番红O的电压敏感实验验证了(5F12•BF12)n输运钾离子的高选择性的性能。基于HPTS的活性测定结果证明，(5F12•BF12)n（n在脂膜中可能等于3）具有极好的K+转运活性，其EC50=1.5μM，相对于脂类分子的摩尔比为1.8mol%，（换算成单通道分子含量则为0.5μmol/L或0.62mol%），其基于单通道电压测定的K+/Na+选择性为20.1，为迄今报导的所有钾离子通道中的最高值。
Fig.3.(a)在2.6mmol/L含量下(5F12‧BF12)nI的离子选择性。(b)总含量为4.9mmol/L，摩尔比为2:1，总含量为5.2mmol/L，摩尔比为1:1和总含量为5.4mmol/L，摩尔比为1:2时，(5F12‧BF12)n的离子选择性(RK+/RNa+)。c)滴加6to7mmol/L的(5F12‧BF12)n或0.03to0.05mmol/L的(VA)所造成的番红O的萤光变化(λex=522nm,λem=581nm;60nmol/L)。LUV囊泡内含/LK2SO4，pH为7的10mmol/L的HEPES缓冲液中则含/LK2SO4或100mmol/LK2SO4。t=0时的起始背景硬度F0设置为1。(d)不对称浴场中记录的单通道电压迹线(cis=0.25mol/LK2SO4;trans=0.25mol/L)。(e)使用线性欧姆电压-电流（I-V）曲线测定的(5F12)n‧(BF12)m的K+/Na+选择性，该异质组装体在稀含量下可能以各类方式存在。
核磁共振氢谱实验表明，相对于同质组装体(5F12)n和(BF12)m(图4a,b)，异质组装体(5F12•BF12)n中的质子Ha、Hb、Hc和Hd显著地向低场位移，分别为0.11、0.05、0.04和0.10ppm，这表明(5F12•BF12)n是由5F12和BF12通过构象交替产生。在0.78-50mM范围内，这4种氢原子的物理位移与含量的依赖性都可以用非线性回归剖析得到较好的拟合，表明了这四种氢原子均参与了络合物的产生（图4c）。对质子Ha和Hb的非线性回归的剖析得出了存在电负性同质组装体(5F12)n的推论(图4d)，同时，对质子Hc和Hd的剖析证明了BF12未能产生良好的自组装(BF12)n(图4e)。图4f-4h的MD模拟结构挺好地否认了上述假定，即使用互相兼容的大官能团(苯并冠醚和叔丁基)通过社会自排序可促使异质组装体例如(5Fm•BFm)n或(6Fm•BFm)n（m=8，10，12等)的产生。
图4.(a)异质组装体(5F12‧BF12)n.的结构。(b)常温下，(5F12)n,(BF12)n和(5F12‧BF12)n含量为/L不同质子的相对物理位移。(c,e)在0.78-50mM范围内和常温下，(5F12‧BF12)n,(5F12)n和(BF12)n的质子物理位移与含量的关系。(f,h)(5F12‧BF12)3,(5F12)6和(BF12)6在POPC膜里MD模拟的结构。才能产生构象距离大于