中国医科学院硕士学位论文术中自体血回输对红细胞膜水通道蛋白-2（AQP2）和水通道蛋白-4（AQP4）的影响姓名：****请学位级别：硕士专业：麻醉学指导班主任：**中国医科学院研究生学位论文独创性申明本人声明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，不仅文中非常加以标明和致谢的地方外，论文中不包含其他人早已发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一齐工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明晰的说明并表示歉意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承当一切相关责任。论文作者签名：中国医科学院研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科学院有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科学院。本人保证结业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科学院，且导师为通信作者，通信作者单位亦署名为中国医科学院。中学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的打印件和c盘，容许论文被查阅和借书。中学可以公布学位论文的全部或部份内容（保密内容除外），以采用翻印、缩印或其他手段保存论文。
论文作者签名：直！壁盏指导班主任签名：！堕堕二：英文专著摘要术中自体血回输对红细胞膜水通道蛋白－２（ＡＯＰ２）和水通道蛋白－４（ＡＯＰ４）的影响阐述术中自体血回输对回输红细胞膜水通道蛋白一２（ＡＱＰ一２）和水通道蛋白一４（ＡＱＰ－４）的影响，评估术中自体血的质量，为自体血的临床应用提供理论根据。方式病例选择：随机选择拟行自体血回输的择期放疗患者１９例，恐怕术中失血８００毫升以上，排除术中应用激素和酸性抗生素的病例。标本留置：将同一患者不同时点的血液分为２组，新血水组为对照组：局麻诱导成功后经中心静脉导管取血５毫升细胞膜通道，保存在盛有ＣＰＤＡ．１保存液的试管中，温度放置；自体血组为实验组：应用自体２０００．型（上海京医医疗设备厂）血液回收机回收术野的失血，经吸引，抗凝，高速离心及清洗等多个处理过程得到的红细胞悬液，回收完毕后立刻取尿样７毫升，其中２毫升分别立刻行血常规和血气剖析。检查指标：血象、血气剖析（ＰＨ值和血压）、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检查标本中水通道蛋白－２（ＡＱＰ２）和水通道蛋白一４（ＡＱＰ４）抒发。统计学剖析：所得数据均以“均数士标准差”来表示，实验组和对照组之间比较用ｔ检验，用ＳＰＳＳｌ３．０统计软件包进行统计学剖析，Ｐ＜０．０５觉得有明显性差别。
结果自体血组：血象中白细胞和血小板显著降低，红细胞变化不显著；血气剖析中ＰＨ值显著下降，血压升高；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹表明白体血组：水通道蛋白一２（ＡＱＰ．２）和水通道蛋白一４（ＡＱＰ．４）显著降低；推论术中自体血回输过程使红细胞膜水通道显著降低，影响了红细胞的微观形态，是影响自体血质量的诱因之一。关键词自体血回输水通道蛋白（ＡＱＰｓ）红细胞膜Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｔｒａ—ｏｐｅｒａｔｉｖｅａｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｏｎｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅＡｑｕａｐｏｒｉｎ－－４ｏｂｊｅｃｔｉｖｅＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｅｔｈｅｓｉｓｉｓｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＩｎｔｒａ－ｏｐｅｒａｔｉｖｅＡｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（ＩＡＴ）ｏｎｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅＡｑｕａｐｏｒｉｎ－４Ａｑｕａｐｏｒｉｎ－２．ＭｅｔｈｏｄｓＮｉｎｅｔｅｅｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｈｏｕｎｄｅｒｔｏｏｋｅｌｅｃｔｉｖｅｏｐｅｒａｔｉｏｎｕｎｄｅｒｇｅｎｅｒａｌａｎｅｓｔｈｅｓｉａｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒＩＡＴ．Ｔｈｅｙｗｅｒｅｅｓｔｉｍａｔｅｄｔｏｌｏｓｅｂｌｏｏｄｏｖｅｒ８００ｍ１．Ｉｆｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｕｓｅｏｆｈｏｒｍｏｎｅａｎｄａｌｋａｌｉｎｉｔｙｄｒｕｇ，ｉｔｗｏｕｌｄｂｅｅｘｃｌｕｄｅｄ．ＦｉｖｅｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓＲＢＣｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｃｅｎｔｒａｌｖｅｎｏｕｓｃａｔｈｅｔｅｒａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｇｒｏｕｐｌｗｅｒｅｐｒｅｓｅｒｖｅｄｗｉｍｔｈｅＣＰＤＡ－ｐｒｅｓｅｒｖｅｄａｔｔｈｅｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．ＩＡＴｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｓａｖｅｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｇｒｏｕｐ）．Ｗｅｓｔｏｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇＷａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｏｆｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅＡｑｕａｐｏｒｉｎ－４ＲｅｓｕｌｔＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｄｅｃｒｅａｓｅｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅＡｑｕａｐｏｒｉｎ－４ｏｎｅｏｆｆａｃｔｏｒｓｔｈａｔｍａｋｅｔｈｅｄｅｃｌｉｎｅｉｎｑｕａｌｉｔｙｏｆＩＡＴ．ｓｍｉｃｆｏｒｍ，ｐｏｓｓｉｂｌｅｔｈｅａｕｔｏｂｌｏｏｄｑｕａｌｉｔｙ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｑｕａｐｏｒｉｎｓＲｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｔｒａ－ｏｐｅｍｔｉｏｎａｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ论文术中自体血回输对红细胞膜水通道蛋白－２（ＡＱＰ２）和水通道蛋白－４（ＡＱＰ４）的影响随着各类高难复杂放疗的举办，临床上对血液的需求越来越多。
因为血液的过剩及异体输血可能带来的并发症，术中自体输血技术得到广泛的应用。术中自体血回输（ＩｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅＡｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，ｔａＴ）是指在放疗中把术野的失血搜集处理后回输给病人的技术。这些技术的举办解决了稀有血型围术期血源短缺的问题。负压吸引，抗凝，高速离心及清洗等多个处理过程会对红细胞引起一定程度的化学和物理损伤，影响红细胞在体内的生物化学性质甚至其携氧能力。水通道蛋白是存在红细胞膜上的结构蛋白，功能主要是对水的单向通透，其结构的改变或则其数目的增减还会影响水分子的通透，从而可以影响红细胞的形态和功能。本实验运用Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ印迹法对术中自体血的红细胞膜的水通道蛋白的抒发进行了研究，借以阐述术中自体血回输对红细胞膜水通道蛋白（ＡＱＰｓ）的影一、病例选择临床资料与方式１、病例选择选定拟行自体血回收，术中失血量超过８００毫升的择期放疗患者１９例，其中脑内科２例，眼科３例，肾脏内科１４例，除外术中应用激素和酸性液体的病例。将同一患者不同时点的血液分为２组。实验组为自体血组，应用自体２０００．型血液回收机（上海京医医疗设备公司）回收术野的血。经过搜集，抗凝，过滤，离心，清洗全程血液回收处理（图１）。
实验组在血液回收完毕后立刻取尿样７毫升，２毫升分别做验血和血气剖析。对照组为新血水组，麻醉诱导成功后经中心静脉导管取血５毫升，温度下放置在盛有ＣＰＤＡ．１保存液中的试管中，待自体血标本留置后，将标本深高温保存，直至最后一个标本取完。图１，术中自体血（ＩＡＴ）回收的处理过程模式图２、主要仪器和试剂全手动血细胞剖析仪（ＨＰ．１２５，日本）Ｂａｙｅｒ血气电解质剖析仪（日本）深高温冰柜（美国）高速冷藏离心机（Ｓｉｇｍａ３Ｃ１５Ｋ日本）多功能电泳仪（上海五一器厂），紫外分光光度计（Ｕｖ－３０００，美国凝胶手动成像及剖析系统（ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ５５００，日本）转运电泳槽（上海五一仪器厂）乙酸纤维膜购自英国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司。兔抗多克隆抗原ＡＱＰ２，ＡＱＰ４（Ｈ－８０），ＳＣ．２０８１２，ｓａｎｔａＣｒｕｚＣＰＤＡ．１保存液（南京万华生物有限公司）一次性使用血液回收套件（广州菲拉尔医疗用具有限公司）３、检测指标验血（白细胞，红细胞和血小板），血气剖析（ＰＨ值，血压）；自体血回收处理完毕后立刻行验血和血气剖析。水通道蛋白的灰度值比率。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹测量将标本从深高温冰柜取出后，温度放置熔化，把尿样反复离心后，弃碱液，加入０．２毫升细胞裂解液［１００ｍｍｏｌ／Ｌ嘶ｓ／Ｈｃｌ（ＰＨ７．５），１００ｍｍｏｌ／ＬＮａｃｌ细胞膜通道，０．５％脱氧胆酸钠，ｌｍｍｏｌ／Ｌ己二胺四羧酸（ＥＤＴＡ），１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ一４０，０．１％十二羰基氯化钠ＳＤＳ］提取的细胞总蛋白样品经Ｌａｒｒｙ法定量，取５ｇ蛋白上样体到１５％的ＳＤＳ．聚丙烯丙酯凝胶，电泳（１００Ｖ，１．５ｈ）。
待溴酚蓝步入凝胶底片后，用抗ＡＱＰ４和ＡＱＰ２抗原孵育，最后加入用酸性乙酸酶（ＡＰ）标记的相应二抗，用０－ＤＩＡＮＩＳＩＤＩＮＥ，ＴＥＴＲＡＺＯＴＩＺＥＤ和－ＮＡＰＨＴＨＹＬＡＣＩＤＰＨＯＳＰＨＡＴＥ显色剂进行显色后，凝胶成像仪剖析。４、统计学处理数据结果以均数标准差表示，应用统计软件ＳＰＳＳｌ３．０进行统计学剖析，组间比较用配对ｔ检验，Ｐ＜０．０１为差别有明显性。对Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹测量结果应用凝胶图像剖析系统进行灰度剖析。实验结果ｌ、全手动细胞剖析仪得到的回收后的自体血中白细胞和血小板显著降低，如表１，ｐ＜０．０１有明显差别，而红细胞经过配对检验后，没有差别（Ｐ＞０．０５）。表１，新血水和自体血验血的变化｝差别有明显性。２、血气剖析得到：自体血ＰＨ值显著下降，与新血水组比，ｐ＜０．０１，有明显差别。自体血组血压显著增长，与新血水组比，ｐ＜０．０１，有明显差别。见表２表２，新血水和自体血血气剖析的ＰＨ值和血压木差别有明显性。３、Ｗｅｓｔｅｍ印迹测量的结果１．新血水组；２．自体血组图２，Ｗｅｓｔｏｎｂｌｏｔ印迹检查新血水组和自体血组水通道蛋白．２和水通道蛋白－４的抒发（ｎ＝１９）。
１４０１２０１００８０６０４０２０时间图３，ＡＱＰ４的灰度值的直方图１．新血水组；２．自体血组。１２０理１００８０６０４０２０时间图４，ＡＱＰ２的灰度值的直方图，１．新血水组；２．自体血组讨论术中自体输血的血液成份主要是红细胞，自体血的验血就可以看出，血小板和白细胞的数目显著降低，红细胞的数目变化不明显，因此评价自体血的质量主要是评价红细胞的质量。当回收的红细胞不经过处理时，会形成一些结构和功能的变化，如红细胞由双凹面结构的圆盘状转变为棘形及球状，使红细胞在通过内皮网状系统容易被吞噬，但是就会丧失携氧的功能，这种就会减少自体血的质量【１１。在回收过程中经过负压吸引及离心、过滤、生理盐水的漂洗等一系列的处理过程后，异型红细胞及其大量碎片被清理，得到的回收自体血红细胞的形态在普通光镜下显著改观，但是有一些红细胞即使在结构上完整，普通光学显微镜不能１０判定其变化，但其功能早已发生了变化，回输到体内后携氧能力下滑，参与血液循环时因剪切挠度发生破碎，释放流血红蛋白而对心脏导致损害。因而会影响到回收自体血的质量。目前国外外关于回收血红细胞质量的文献报导多侧重于测量红细胞ＡＴＰ酶、葡萄糖．６．乙酸酶活性、红细胞ＡＴＰ浓度、红细胞延性、对凝血功能的影响以及对红细胞的免疫等等，以回收血红细胞功能的研究为主【７’９】，对红细胞膜的基本结构．水通道蛋白（ＡＱＰＳ）的研究尚未见到。
水通道蛋白（ＡＱＰＳ）是一种高度通透水份子的蛋白，是１９８８年Ａｇｒｅ等【ｌＯｌ对红细胞膜分离，纯化Ｒｈ氨基酸时发觉了一个２８ＫＤ的疏水跨膜蛋白，１９９１年完成了其ｃＤＮＡ克隆［２１，次年进行了功能鉴赳３１。Ａｇｒｅ００１等的研究表明，单个水通道具有特别强的单向通透水份子的能力，通透速率为（１００．２００）ｘ１０．６ｍ．Ｓ．１ｔ４－６】，这种私密性可以达到脂类双分子层的１０到１００倍，私密性受渗透压、ＰＨ值、激素等的调节。水通道蛋白（ＡＱＰｓ）最初发觉是在红细胞膜上，证明其对水的高通透功能也是通过红细胞膜得出推论的。水通道蛋白（ＡＱＰｓ）是一个家族，至今发觉１２个成员，依据其基因结构和序列同源程度，该家族成员可分为３组，其中ＡＱＰ０、