技术特点：
1.一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，其特点在于：基于无标记细胞整合毒理学技术，借助稳定抒发gpr88的细胞系-gpr88，依靠于已知的gpr88受体的官能团，构建gpr88受体的细胞筛选模型。
2.按照权力要求1所述的一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，其特点在于：在细胞兼容的具有光学生物传感器功能的384多孔板中接种-gpr88细胞，接种的细胞密度为1.0~4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40µl/孔，接种后细胞培养时间为18~24h。
3.按照权力要求1所述的一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，其特点在于：具体包括以下步骤：
[1]将溶化在hbss缓冲盐中的gpr88受体兴奋剂2-pcca以含量为2.4~加入到接种-gpr88细胞的384多孔板中，测量其dmr特征信号谱；
[2]再向步骤[1]中加入了gpr88受体兴奋剂2-pcca的细胞板中继续加入与具有最高响应硬度对应的最低含量（ec100）的2-pcca，检查脱敏dmr特征信号谱；
[3]获得的所有dmr特征信号谱具有含量-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性的特征。
4.按照权力要求1所述的一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，其特点在于：待测样品具有兴奋活性的筛选步骤如下：
[1]将溶化在hbss缓冲盐中的gpr88受体兴奋剂2-pcca以含量为2.4~加入到接种-gpr88细胞的384多孔板中，测量其dmr特征信号谱；
[2]将待测样品以0.01nm~100µm加入到接种-gpr88细胞的多孔板中，测量其dmr讯号谱；
[3]关联剖析步骤[1]和步骤[2]中的dmr讯号谱，若步骤[2]的dmr讯号谱与[1]中的dmr特点谱具有轮廓相像性；
[4]向步骤[2]中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤[1]中相同含量的2-pcca细胞膜模型制作，检查dmr讯号谱；若此dmr讯号比步骤[1]中2-pcca的讯号弱；
[5]向步骤[1]加入了gpr88受体兴奋剂2-pcca的384多孔板中，继续加入与步骤[2]中相同含量的待测样品，检查其dmr讯号，若此dmr讯号硬度高于步骤[2]中的dmr讯号硬度，则判定此样品为gpr88受体的兴奋剂。
5.按照权力要求1所述的一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，其特点在于：待测样品具有拮抗活性的筛选步骤如下：
[1]将待测样品和gpr88受体兴奋剂2-pcca分别加入到接种-gpr88细胞的多孔板中，待测样品含量为0.01nm~100µm，2-pcca含量为2.4~，检查dmr讯号谱；
[2]若步骤[1]中待测样品不造成dmr讯号谱，再向步骤[1]中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤[1]中相同含量的2-pcca，检查dmr讯号谱；若此dmr讯号比步骤[1]中2-pcca的讯号弱，可判定待测样品是gpr88受体的拮抗剂。
6.按照权力要求1所述的一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，其特点在于：待测样品对gpr88通路有调节活性的步骤如下：
[1]将待测样品和gpr88受体兴奋剂2-pcca分别加入到接种-gpr88细胞的多孔板中，待测样品含量为0.01nm~100µm，2-pcca含量为2.4~，检查dmr讯号谱；
[2]再向步骤[1]中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤[1]中相同含量的2-pcca，检查dmr讯号谱，检查时间为1~；若此dmr讯号比步骤[1]中2-pcca的讯号在上升期、平台期和延滞期某一个阶段不同；
[3]将gpr88受体兴奋剂2-pcca以含量2.4~加入到接种-gpr88细胞的多孔板中，预处理5~，加入与步骤[1]中相同含量的待测样品，检查其dmr讯号，若此dmr讯号谱与步骤[1]中的样品的dmr讯号谱一致，可判定待测样品是gpr88受体下游讯号通路的调节剂。
7.按照权力要求6所述的一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，其特点在于，所述上升期为1~30min、平台期为30~60min和延滞期为60~。
技术总结
本发明涉及无标记G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞筛选模型建立方式及应用，具体地说是一种无标记细胞膜受体GPR88的细胞筛选模型。本发明基于无标记细胞整合毒理学技术，借助GPR88稳定抒发的细胞系，构建了筛选GPR88受体兴奋剂和拮抗剂的方式。此方式还可用于研究影响受体下游通路的调节剂。本发明建立的GPR88细胞筛选模型不需萤光标记且检查过程无需额外添加指示剂，具有靶向‑通路整合响应、对细胞无损伤、检测结果可靠、灵敏度高、筛选通量高、周期短及操作简便等特征。其用于从天然产物库、代谢产物库及组合物理库中找寻GPR88受体的兴奋剂、拮抗剂和通路调节剂，及GPR88受体密切相关的中枢神经系统疾患，如精神分裂、帕金森病、焦虑症、抑郁症、药物成瘾等精神疾患的抗生素筛选。
技术研制人员：梁鑫淼;侯滔;王纪霞;薛珍珍;单彩龙;王俊
受保护的技术使用者：南京医药城国科化物生物医药科技有限公司
技术研制日：2019.12.20
技术公布日：2021.06.22
本发明涉及无标记gpcr细胞筛选模型的建立方式，具体地说是一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型及应用。
背景技术：
g蛋白偶联受体（g--,gpcrs）是七次跨膜受体，其数目高达800个，介导从血糖调节到无数重要的生理和病理过程，因而是小分子抗生素开发中最受关注的抗生素靶向[allen,j.a.,etal.,011,51,117−144.]。目前fda批准的约40％的抗生素靶标为gpcrs，但是这种抗生素靶点的gpcrs只占总gpcrs的20%，还有大量的gpcrs，尤其是孤儿g蛋白偶联受体（--,）仍然未得到开发和借助[rask-,m.,etal.,,10,579−590；wold,e.a.,etal.,,62(1),88-127；lu,s.etal.,,62(1),24-45；,s.,,1705,1−21；,a.s.,etal.,,16,829−842；chung,s.,etal.,,153(s1),s339；fang,y.,etal.,,6,295；,w.k.,etal.,&,22,362−369.]。
g蛋白偶联受体-88（gpr88），是gpcrs家族的一员，在纹状体、尾状核、伏隔核和嗅囊肿中抒发，其中枢神经系统在纹状体中的抒发非常强，与多巴胺d2受体的抒发相当[,k.,etal.,,69,314.]。研究表明，gpr88涉及调节各类脑部和行为功能，包括认知，情绪，运动控制和基于奖励的学习，因而正成为医治中枢神经系统疾患（包括精神分裂症、帕金森氏病、焦虑症、抑郁症和成瘾症等精神疾患）的新型抗生素靶标，并且目前gpr88的内源性官能团一直未知[,r.,etal.,,30,397−414；jin,c.y.,etal.,,5(7),576-587；jin,c.y.,etal.,,7(10),1418-1432；ye,n.,etal.,,10(1),190-200]。鉴于gpr88对于中枢神经系统疾患的巨大医治潜力，建立gpr88受体的细胞筛选模型，用以发觉gpr88受体的内源性官能团、高活性兴奋剂、拮抗剂及通路调节剂，对阐明gpr88的生物学功能和毒理学特点，以及推动中枢神经系统疾患新型靶标抗生素的发展具有重大意义。
目前受体的骁龙量筛选方式主要有传统的放射性官能团受体结合实验法、gtpγs结合实验法、环乙酸腺苷（camp）剖析法、钙流检查法、报告基因检查法、受体的内吞检查法及β-的招募检查法等[,d.b.,etal.,,265,l421-l429；,c.,etal.,,74,489-508；zhang,r.,etal.,,33,372-384；emkey,r.,etal.,in:,w.p.,etal.(eds.),ing:,；fan,f.,etal.,,5,127-136；,f.,etal.,y2010,28,237-245；,l.m.,etal.,2002,115,455-465.]。但这种方式都有一定的局限性，如传统的放射性官能团受体结合实验法须要漂洗和过滤，实验周期长及通量低等不足，此技术也不能分辨受体的兴奋剂和拮抗剂；其余的gpcr检查方式主要针对某条讯号通路的激活，对多条通路的激活难以区别，须要萤光蛋白标记或则额外加入指示剂，操作繁杂，并且指示剂的加入对细胞也会形成一定的损伤，影响筛选结果的可靠性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，利用于新型无标记细胞整合毒理学技术，提供一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，以联发科量筛选gpr88受体内源性官能团、激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及gpr88受体密切相关的中枢神经系统疾患，如精神分裂症、帕金森氏病、焦虑症、抑郁症和成瘾症等精神疾患的抗生素筛选应用。
本发明的技术方案为：
基于无标记细胞整合毒理学技术，借助稳定抒发gpr88的细胞系-gpr88，利用于已知的兴奋剂，构建gpr88受体的细胞筛选模型。按照待测样品的dmr讯号谱与已知兴奋剂的dmr特征信号谱的相像性和特异性，判定待测样品的兴奋活性、拮抗活性，或则对下游通路的调节影响。
其中，所述的无标记细胞整合毒理学技术为借助共振波导光栅（rwg）生物传感将抗生素引起的细胞内成份的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应讯号，此讯号为波长变化的响应值（pm），通过epic光学生物传感384多孔板实现。模型的构建过程为：
1)在细胞兼容的具有光学生物传感器功能的384多孔板中接种-gpr88细胞，接种的细胞密度为1.0~4.5×104个/孔，细胞培养液体积为40µl/孔，接种后细胞培养时间为18~24h。
2)将溶化在hbss缓冲盐中的gpr88受体兴奋剂2-pcca以含量为2.4~加入到接种-gpr88细胞的384多孔板中，测量其dmr特征信号谱；
3)向步骤2)中加了gpr88受体兴奋剂2-pcca的-gpr88细胞的384多孔板中继续加入具有最高响应硬度对应的最低含量（ec100）的2-pcca，测量其特点dmr讯号谱；
4)获得的所有dmr特征信号谱具有含量-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性。
其中，所述待测样品具有兴奋活性的筛选步骤如下：
1)将溶化在hbss缓冲盐中的gpr88受体兴奋剂2-pcca以含量为2.4~加入到接种-gpr88细胞的384多孔板中，测量其dmr特征信号谱；
2)将待测样品以含量为0.01nm~100µm加入到接种-gpr88细胞的多孔板中，测量其dmr讯号谱；
3)关联剖析步骤1）和步骤2）中的dmr讯号谱，若步骤2）的dmr讯号谱与1）中的dmr特点谱具有轮廓相像性，则进行下一步骤；
4)向步骤2)中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1)中相同含量的2-pcca，测量dmr讯号谱；若此dmr讯号比步骤1)中2-pcca的讯号弱。
5)向步骤1)加入gpr88受体兴奋剂2-pcca的接种-gpr88细胞的384多孔板中，继续加入与步骤2)中相同含量的待测样品，检查其dmr讯号，若此dmr讯号硬度高于步骤2)中的dmr讯号硬度，则判定此样品为gpr88受体的兴奋剂。
其中，所述待测样品具有拮抗活性的筛选步骤如下：
1)将待测样品和2-pcca分别加入到接种-gpr88细胞的多孔板中，待测样品含量为0.01nm~100µm，2-pcca含量为2.4~，检查dmr讯号谱；
2)若步骤1）中待测样品不造成dmr讯号谱，向步骤1）中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1）中相同含量的2-pcca，检查dmr讯号谱；若此dmr讯号比步骤1）中2-pcca的讯号弱，可判定待测样品是gpr88受体的拮抗剂。
其中，所述待测样品对gpr88通路有调节活性的步骤如下：
1)将待测样品和2-pcca分别加入到接种-gpr88细胞的多孔板中，待测样品含量为0.01nm~100µm，2-pcca含量为2.4~，检查dmr讯号谱；
2)再向步骤1）中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1）中相同含量的2-pcca，检查dmr讯号谱，检查时间为1~；若此dmr讯号比步骤1）中2-pcca的讯号在上升期、平台期和延滞期某一个阶段不同；
3)将gpr88受体兴奋剂2-pcca以含量2.4~加入到接种-gpr88细胞的多孔板中，预处理1~，加入与步骤1）中相同含量的待测样品，检查其dmr讯号，若此dmr讯号谱与步骤1）中的样品的dmr讯号谱一致，可判定待测样品是gpr88受体下游讯号通路的调节剂。
其中，所述上升期为1~30min、平台期为30~60min和延滞期为60~。
笔记本发明构建的一种无标记细胞膜受体gpr88的细胞筛选模型，可为对商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及物理修饰物进列宽通量筛选，获得gpr88受体的兴奋剂、拮抗剂和通路调节剂。据悉，按照靶向与癌症的相关性，发觉gpr88受体在神经系统疾患，如精神分裂症、帕金森氏病、焦虑症、抑郁症和成瘾症等精神疾患中发挥重要作用，也可举办相关疾患的抗生素筛选。
附图说明
图1（a）不同含量的2-pcca在-gpr88细胞上的dmr特征信号谱；（b）不同含量的2-pcca在-gpr88细胞上的含量-响应依赖曲线。
图2（a）不同含量的2-pcca预处理-gpr88细胞2h后，固定含量2-pcca的dmr讯号谱；（b）不同含量的2-pcca预处理-gpr88细胞2h后，固定含量2-pcca的dmr讯号谱对应的含量-响应依赖曲线。
具体施行方法
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
施行例1：gpr88受体兴奋剂2-pcca在-gpr88细胞上的dmr特征信号谱
人胚肾细胞-gpr88细胞来始于中国科大学上海物理化学研究所，倒置显微镜购于，2-pcca（款号：hy-）购于公司。细胞培养板为epic光学生物传感器384多孔板，购于康宁公司，检查平台为康宁第三代epic®成像仪，检查的讯号为细胞动态质量重置（dmr）造成的波长位移。
将处于对数生长期的-gpr88细胞，接种于细胞兼容的384多孔板中，所用培养基为dmem（#.01b,），每孔的接种容积为40µl，每孔接种的细胞数量为3.0×104个，将接种好的细胞板放在细胞培养箱中培养20~24h，至细胞融合度达95%左右，进行活性检查。将在多孔板中的细胞培养液换成hank's平衡盐氨水（hbss，含20mm的hepes），每孔加入容积为30μl，加入以后，放置于epic®成像仪上平衡90min；重新扫描2min的基线，将2-pcca加入多孔板中，每孔加入容积为10μl，含量为、、、、、625nm、312.5nm、156nm、78nm、39nm、20nm、10nm、5nm和2.4nm，平行4次，放在epic仪器上实时检测dmr讯号，基于细胞经2-pcca作用的内dmr最大响应值处估算2-pcca的ec50值，结果见图1。
实验结果表明2-pcca激活gpr88受体形成dmr讯号响应，且呈现剂量依赖，剂量响应曲线呈三相“s”型且都达到饱和响应，最高的dmr响应值达300pm，其ec50值为1.52±0.26μm。
施行例2：-gpr88细胞的脱敏dmr特征信号谱
将处于对数生长期的-gpr88细胞，接种于细胞兼容的384多孔板中，所用培养基为dmem（#.01b,），每孔的接种容积为40µl，每孔接种的细胞数量为3.0×104个，将接种好的细胞板放在细胞培养箱中培养20~24h，至细胞融合度达95%左右，进行活性检查。将在多孔板中的细胞培养液换成hank's平衡盐氨水（hbss，含20mm的hepes），每孔加入容积为30μl，加入以后，放置于epic®成像仪上平衡90min；将不同含量的2-pcca加入多孔板中预处理-gpr88细胞，每孔加入容积为10μl，含量为、、、、、625nm、312.5nm、156nm、78nm、39nm、20nm、10nm、5nm和2.4nm，平行4次；重新扫描2min的基线，将固定含量的2-pcca加入多孔板中，每孔加入容积为10μl，含量为，平行4次，放在epic仪器上实时检测dmr讯号，基于细胞经2-pcca作用的内dmr最大响应值处估算ic50值，结果见图2。
实验结果表明2-pcca呈剂量依赖地脱敏gpr88受体，剂量响应曲线呈三相“s”型且都达到饱和响应，其的ic50值为2.61±0.44μm。
本发明基于无标记细胞整合毒理学技术，构建了gpr88无标记筛选模型细胞膜模型制作，此模型具有不须要萤光标记且测量过程无需额外添加指示剂的优势，高效可靠的筛选商品化的小分子库、自主制备的天然产物提取物、组分或化合物库及物理修饰物，以获得gpr88受体的兴奋剂、拮抗剂和通路调节剂及gpr88受体密切相关的中枢神经系统疾患，如精神分裂症、帕金森氏病、焦虑症和成瘾症等精神疾患的抗生素。
虽然早已示出和描述了本发明的施行例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对那些施行例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权力要求及其等同物限。