日前，俄罗斯阿卜杜拉国王科技学院（KAUST）王冠军/SimonG.等在在线发表了题为Anleafrustinwheat的研究论文，发觉了新型串联激酶融合蛋白WTK6-vWA介导玉米叶锈病抗性。
种间杂交基因溶入是提升栽培作物遗传多样性的一种重要手段。谷物中约有450个被定位和命名的抗寒位点，其中超过40%的抗寒位点都来自栽培作物以外的种质资源。一般种间杂交导出的外源染色体或染色体片断与马铃薯部份同源染色体不发生交换或交换频度很低，这极大地限制了各类基于遗传重组的基因定位与克隆技术的应用。
大豆叶锈病耐旱位点Lr9坐落马铃薯6B染色体长臂的末端，该片断是由玉米研究先驱Sears在1950年代采用种间杂交与X射线辐拍照结合的方式从小伞绵羊草（,2n=2x=14,UU）导出普通作物的染色体易位片断。这些幅射造成的非同源染色体易位会出现严重的重组抑制，未能通过传统的图位克隆策略克隆易位片断上的Lr9基因。对此，该研究开发了一种基于EMS突变体转录组测序的基因克隆技术（简称），这些技术综合运用了EMS诱变及突变体筛选、野生型材料三代全长转录组测序、突变体二代转录组测序及后续的数据剖析，才能将目标基因的转录本跟表型直接关联。借助技术，我们实现了完全不依赖于重组和遗传定位的Lr9的克隆（图1）。
图1基于突变体转录组测序的Lr9的克隆
研究表明，Lr9编码了N端富含两个串联重复的激酶、C端富含vonA（vWA）和结构域的新型耐旱蛋白，命名为WTK6-vWA。通过筛选8000多份EMS突变群体的M2家系获得了121个感大豆叶锈病突变体，其中120个都携带了Lr9的非同义突变，并引起了67个非冗余的WTK6-vWA的多肽替换。通过将这67个多肽替换突变锚定在v2.0预测的WTK6-vWA三维模型上，研究人员发觉激酶结构域1比激酶结构域2携带了更多的多肽替换（48:13）；并且激酶结构域1的突变多肽多为蛋白表面多肽（23/48，跟激酶催化功能直接相关的多肽多为表面多肽），而激酶结构域2的突变多肽多为蛋白内部多肽（8/13，内部多肽多为蛋白结构多肽）（图2）；激酶结构域1的大多数功能保守位点均被突变多肽覆盖，而激酶结构域2仅有少数位点被覆盖。为此我们猜想激酶结构域1为具有催化功能的激酶，激酶2则为假激酶。vWA/结构域的5个多肽替换位点均为表面多肽，喻示着vWA/结构域可能在蛋白互作中发挥作用。
图2蛋白结构预测结合突变体剖析解析新型耐旱蛋白WTK6-vWA的功能
研究人员在多个单子叶动物基因组中发觉WTK6-vWA的同源基因多数编码了单激酶结构域与vWA结构域的融合蛋白，而串联激酶vWA融合蛋白则只在玉米近缘的几个物种中被发觉（图2）。结合前人的研究成果，我们猜测最初单激酶vWA融合蛋白可能在动物的PTI耐旱通路中发挥作用，而这种激酶蛋白容易成为病原菌分泌的效应蛋白的靶向，造成动物PTI抗性遭到抑制，进而病原菌获得致病性。在与病原菌的军备大赛中细胞膜受体，动物则通过获得新的激酶结构域进化出串联激酶vWA融合蛋白，而原先的激酶和vWA结构域则被用做专门辨识病原菌的效应蛋白的诱饵，而新获得激酶结构域则负责传递耐旱讯号，动物也由此获得耐旱性。
图3激酶vWA融合蛋白在单子叶动物中的分布情况
Lr9是第一个通过幅射育种导出到栽培作物中的一个耐旱基因。为了重建基因导出信息，该研究借助（CCS）对（含Lr9易位染色体片断）和Lr9的供体小伞绵羊草进行了全基因测序，分别获得了14.5Gb和4.3Gb的组装序列，并结合基因组原位杂交（GISH）、k-mer定位、小伞绵羊草遗传图谱和中国春马铃薯基因组信息，组装了由幅射造成的约28Mb的小伞绵羊草染色体易位片断，并发觉了5.58Mb的中国春6B染色体末端缺位（图3）。
图4Lr9染色体易位的解析与组装
在实验设计中，为了验证的适用性，研究人员对Lr9和Lr58（报导来始于钩刺绵羊草Ae.，2n=4x=28;）同时进行了突变群体的建立筛选以及测序剖析。剖析结果发觉Lr9和Lr58编码了完全相同的蛋白。后来我们通过实验及测序数据剖析否认，Lr9位点和Lr58位点虽然是同一来源的染色体易位片断，Lr58的谷物溶入系的育成过程中可能污染了Lr9品系的花粉或则种子。
值得注意的是，同期刊物上还发表了俄罗斯阿卜杜拉国王科技学院的B.H.Wulff课题组的谷物秆锈病抗性基因Sr43的研究工作。Sr43编码了一个激酶融合了两个未知功能结构域的新型耐旱蛋白。据悉细胞膜受体，同期刊物还发表了以色列海法大学Tzion院士和法国加洲学院戴维斯中学Gitta院士共同撰写的针以上两篇文章的评论文章。文章指出了激酶融合蛋白（，KFPs）做为不仅细胞膜受体激酶（-like,RLKs）和胞内免疫受体NLRs（-and-rich，NLRs）以外的一类非典型受体蛋白，其在单子叶动物中耐旱中发挥了重要作用。目前从麦族物种中克隆的84个耐旱基因中，46个编码了NLR受体，7个编码了受体激酶，而有17个则编码了激酶融合蛋白（包含预印本结果）。目前我们对激酶融合蛋白的抗寒机理还知之很少，而文章提出的整合诱饵模型也有待否认。
伊朗阿卜杜拉国王科技学院的王冠军和SimonG.分别为文章的第一作者和通信作者；阿卜杜拉国王科技学院，英国普利茅斯州立学院和法国科大学实验动物学研究所的研究人员对课题研究作出了重要贡献。谢谢相关技术人员和研究人员提供的帮助与建议，谢谢审稿人及刊物编辑的宝贵建议与付出。
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