胆固醇是人体固醇代谢的产物，在体内过度积累会引起高胆固醇血症。而甘油三酯盐晶体在关节、肾脏等组织中过度沉积能诱发癫痫[1]和慢性心脏病症[2]等。流行病学研究显示喝酒、吸烟、肥胖、糖尿病、高血脂和血压异常等是诱发高胆固醇血症的主要危险诱因[3-4]。据统计，2018—2019年中国成年人的高胆固醇血症得病率为14.0%，相比2015—2016年患癌率明显下降。目前临床常用的降血胆固醇抗生素，包括黄固醇氧化酶抑制剂、促血糖排尿抗生素和重组血糖酶剂型等，都存在着一定的局限性，如别嘌醇可能诱发超敏反应，非布司他具有潜在的心血管风险，苯溴马隆具有损伤转氨酶能、酸化精液、减少胆固醇代谢和排尿的不良反应[5]，这使得研究者进一步研制高效广谱的抗高血脂抗生素。
高血糖血症的主要诱因是固醇代谢衰弱而导致的胆固醇形成过多或排尿失衡。研究发觉，胰脏中的黄固醇氧化还原酶（，XOR）是参与固醇分解代谢的关键酶，XOR由黄固醇酯化酶（，XDH）和黄固醇氧化酶（，XOD）组成，前者在血糖的生成过程发挥着重要作用[6-7]。据悉，XOD还可通过形成超氧化物和二溴化氢推动体内活性氧（，ROS）的形成。另有研究表明，胆固醇一旦步入细胞，都会成为一种促氧化剂细胞膜水通道，降低ROS的过度生成[8-9]。
线粒体与机体的氧化还原稳态密切相关。损坏的线粒体能引起机体ROS的过度积累[10-11]。反过来，ROS积聚也可能造成线粒体功能损伤[12]。研究表明，线粒体融合与分裂活动由诸多线粒体功能蛋白参与完成，其动态平衡是线粒体维持有效功能的关键[13]。二溴化物酶体增殖物活化受体γ辅助活化因子-1（-gamma-1，PGC-1）家族参与线粒体产生和能量代谢，且在调控其他细胞功能方面也发挥着核心作用[14]。PGC-1α在氧化应激中推动抗氧化酶的转录，并参与调控脂肪酸氧化、三乙酸循环、氧化应激反应、线粒体生物发生和动力学等相关基因的抒发[15]。另有研究发觉，高胆固醇血症可造成小鼠肝脏线粒体功能障碍，其病理机制与肾皮质氧化应激损伤相关[16]。
四妙散首载于清代医家张秉持所著的《成便捷读》，由黄柏、苍术、牛膝、薏苡仁4味草药组成，以黄柏为君药，其主要功效为祛风利湿，临床常应用于燥热下注所致筋络肿胀、下肢痿软无力、足膝肿胀酸痛等症。研究表明，四妙散具有医治哮喘和脑病综合征等的功效[17]，这些作用可能与调节抗氧化酶的活性有关[18]。并且，四妙散能够通过调节胰腺组织线粒体的生物活性，提高机体抵抗氧化应激的能力，从而改善血胆固醇的代谢和肾功能，尚未见相关报导。为此，本研究以氧嗪碘化钾和次黄固醇联合诱发的高血糖血症大鼠为模型，阐述四妙散减少血胆固醇的作用以及对心脏线粒体相关蛋白的影响，以期为预防高胆固醇血症及其并发症的抗生素研究提供新的策略。
1材料
1.1植物
48只SPF级雌性广州种家兔，体质量（20±2）g，由斯贝福（上海）生物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2019-0010。所有家兔均以正常草料适应性喂养1周。实验方案经上海中医药学院植物实验伦理委员会批准（批准号BUCM-4-202）。
1.2草药
四妙散由黄柏、苍术、牛膝和薏苡仁组成，以上草药购自上海同寿堂股份有限公司，经上海中医药学院王学勇院士鉴别为芸香科动物白皮树.的干燥树根、菊科动物北柴胡(DC.)Koidz.的干燥块茎、苋科动物当归Bl.的干燥根、禾专科动物薏苡Coix-jobiL.var.(Roman.)Stapf的干燥成熟蒴果。
1.3药品与试剂
对照品硫酸小檗碱（批号633-65-8，质量分数＞98%）、β-脱皮激素（批号5289-74-7，质量分数＞98%）购自上海瑞芬思生物科技有限公司；氧嗪碘化钾（批号）、次黄固醇（批号）购自北京麦克林生化科技有限公司；别嘌醇（批号）购自北京信谊万象制药股份有限公司；血糖测试盒（批号C12-2-1）、XOD测试盒（批号A002-1-1）、微量还原型芦丁（，GSH）测定试剂盒（批号A006-2-1）、氧化型芦丁（，GSSG）测试盒（批号A061-1-2）、丙二醛（，MDA）测试盒（批号A003-1）、超氧化物歧化酶（，SOD）测定试剂盒（批号A001-3-2）购自上海建成生物工程研究所；线粒体融合蛋白1（1，MFN1）抗原（批号66776-1-Ig）、MFN2抗原（批号12186-1-AP）、视神经萎缩相关蛋白1（optic1，OPA1）抗原（批号27733-1-AP）、线粒体动力相关蛋白1（-，DRP1）抗原（批号12957-1-AP）、PGC-1α抗原（批号66369-1-Ig）、β-actin抗原（批号66009-1-Ig）、HRP标记的绵羊抗兔IgG二抗（批号-2）、HRP标记的绵羊抗鼠IgG二抗（批号-1）购自公司。
1.4仪器
型电子天平（美国公司）；FLUOstarOmega多功能酶标仪（日本BMG公司）；22331离心机（美国公司）；电泳和转膜装置（日本Bio-Rad公司）；型全手动物理发光/萤光图象剖析系统（北京天能公司）；HPLC/Q-TOF-MS剖析仪（英国公司）；BX53型倒置显微镜（美国公司）。
2方式
2.1四妙檐口提液的制备及主要成份浓度测定
将适量四妙散（黄柏15g、苍术15g、牛膝10g、薏苡仁30g，总生用量为70g）先加入10倍容积的去离子水，泡制2h后倒出，再加入8倍容积的去离子水，泡制2h后倒出，合并水煎液，滤去药渣，浓缩至所需的含量。依据临床成人生用量和体表面积法，四妙散中剂量组大鼠给用量为9.1g/kg，低、高剂量组大鼠给用量分别为4.55、18.2g/kg。
四妙勒脚提液稀释100倍得进样样品，对照品精准称定并溶于乙醇，配得30μg/mL硫酸小檗碱和1mg/mLβ-脱皮激素，之后将样本和对照品通过0.22mm膜滤过，再进行HPLC/Q-TOF-MS剖析。色谱条件：C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；流动相为苯酚（A）-0.1%乙酸水氨水（B），梯度洗脱：0～50min，95%～10%B；50～50.1min，10%～95%B；50.1～55min，95%B；柱温35℃；容积流量0.3mL/min；进样量10μL。质谱条件：正、负离子模式；质量范围m/z100～1500；离子源喷雾电流3.5kV；碰撞能量35eV；毛细管气温320℃；探头加热气温400℃。结果用进行剖析。
2.2高胆固醇血症大鼠分组、造模及给药
大鼠适应性喂养1周后，随机分成对照组、模型组、别嘌醇（5mg/kg）组和四妙散低、中、高剂量（4.55、9.1、18.2g/kg）组，每组8只。按照Zhang等[19]造模方式复制高血糖大鼠模型，除对照组外，其余大鼠分别用氧嗪碘化钾（300mg/kg，0.9%生理盐水配制，ip）和次黄固醇（500mg/kg，0.5%羧丙基纤维素钠配制细胞膜水通道，ig）造模。对照组大鼠分别ig等容积0.5%羧丙基纤维素钠和ip等容积生理盐水，1次/d。每次造模1h后ig给药，对照组和模型组ig等容积去离子水，连续7d。第6天给药后，将幼鼠放置代谢笼中搜集汗液。第7天给药1h后分别取血、肝脏和胰脏，其中一部份肾脏和肝脏放在−80℃冻存，另一部份放在4%多聚甲醛固定。
2.3血浆生化指标测定
根据试剂盒说明书测定血浆和精液中胆固醇浓度，测定血浆中GSH、GSSG、MDA浓度及SOD活力，肝组织XOD活力以及肾组织GSH浓度。
2.4苏木素-伊红（HE）染色观察肾组织病理变化
将固定在4%多聚甲醛滤液中的心脏组织根据常规HE染色法进行脱水、包埋、切片和染色，中性树胶封片后放在倒置显微镜下观察心脏组织病理变化并照相。
2.测量肾组织MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和PGC-1α蛋白抒发的影响
将适量的心脏组织用RIPA裂解液裂解，之后采用高温机械匀浆的方式提取组织蛋白，BCA法测定蛋白含量。将变性蛋白样品经10%十二羰基氯化钠-聚丙烯丙酯凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后，分别加入MFN1（1∶4000）、MFN2（1∶4000）、OPA1（1∶2000）、DRP1（1∶1000）和PGC-1α（1∶4000）抗原，4℃孵育过夜。隔日，加入二抗（1∶4000），温度孵育1h后，用ECL超敏发光液显色，Azure凝胶成像仪照相。以相应的β-actin作为内参，借助ImageJ图象剖析软件对各目标条带的灰度值进行半定量剖析。
2.6统计学剖析
借助prism8.0软件对数据进行统计剖析，用表示。数据满足正态分布且残差齐时采用单诱因残差剖析（ANOVA）；残差不齐时使用近似F检验。数据不满足正态分布时，则使用非参数检验。
3结果
3.1四妙檐口提液的主要物理成份剖析
借助UPLC/MS技术测定四妙散中的硫酸小檗碱和β-脱皮激素的浓度。通过面积归一化法[20]以对照品和样品中硫酸小檗碱与β-脱皮激素的色谱图（图1）峰面积估算得，硫酸小檗碱在四妙散中的质量分数为7.6mg/g，占黄柏生药浓度的3.54%；β-脱皮激素在四妙散中的质量分数为1.9mg/g，占当归生药浓度的1.36%。《中国药典》2020年版规定[21]，小檗碱在黄柏中质量分数不高于3%，β-脱皮激素在泽兰中质量分数不高于0.03%，本研究四妙散中硫酸小檗碱与β-脱皮激素的浓度符合《中国药典》2020年版规定。
3.2四妙散对高胆固醇血症大鼠血浆和精液中胆固醇浓度的影响
如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠血浆中胆红素水平明显下降（P＜0.001），精液中胆红素水平明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组血浆中胆红素水平明显减少（P＜0.001），精液中胆固醇水平明显下降（P＜0.05、0.01、0.001）。由实验结果可知，各剂量的四妙散均显著降低血液中胆固醇浓度，促使血糖随精液排出体外。但是，不同剂量的四妙散增加血浆胆固醇的疗效无显著差别，低、中剂量的四妙散推动血糖随精液的排尿的作用显著低于高剂量的四妙散（P＜0.05）。以上结果提示，四妙散能减少高血糖血症大鼠血液中的胆固醇水平，同时推动胆固醇经肝脏的排尿。
3.3四妙散对高胆固醇血症大鼠血浆中GSH、GSSG、SOD、MDA浓度的影响
如图3所示，与对照组比较，模型组大鼠血浆中GSH水平和SOD活力明显减少（P＜0.05），GSSG和MDA水平明显下降（P＜0.05、0.001）；与模型组比较，各给药组血浆中GSH水平和SOD活力明显下降（P＜0.05、0.01、0.001），GSSG和MDA水平明显升减少（P＜0.05、0.001）。以上结果表明，四妙散才能促使高血糖血症大鼠的还原氧化平衡，进而改善大鼠机体的氧化应激状态。
3.4四妙散对高血糖血症大鼠肠道XOD的影响
如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠肝匀浆中XOD活力明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组肝匀浆中XOD活力明显减少（P＜0.05）。表明四妙散干预能减少高血糖血症大鼠肠道中XOD的活性，抑制胆固醇的生成。
3.5四妙散对高血糖血症大鼠肝脏组织病理变化的影响
如图5所示，对照组大鼠的肾小球、间质和肾小管形态正常，细胞排列紧密。模型组大鼠肾组织内肾小球萎缩，肾小管扩张且扩张腔内可见肾小管上皮开裂，管型，肾小管空泡化，结构不清。与模型组比较，四妙散组大鼠肾组织损伤程度显著减缓，肾小管扩张和肾小球萎缩显著改善。以上结果表明四妙散对高血糖诱发的心脏损伤具有保护作用。
3.6四妙散对高胆固醇血症大鼠肝脏中GSH浓度的影响
如图6所示，与对照组比较，模型组大鼠肝脏中GSH水平明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组心脏中GSH水平明显下降（P＜0.05、0.01），这表明四妙散能提升高胆固醇血症大鼠肾组织的抗氧化能力。
3.7四妙散对高胆固醇血症大鼠肝脏组织MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和PGC-1α蛋白抒发的影响
因为四妙散低剂量在改善血糖代谢方面，与中、高剂量具有类似或则较好的疗效，所以本实验仅研究四妙散低剂量改善肾损伤的可能作用机制。既往研究提示，MFN1、MFN2调控线粒体外膜的融合，OPA1调控线粒体内膜的融合，DRP1调控线粒体的分裂，PGC-1α调控线粒体的能量代谢、参与线粒体结构产生[22-23]。如图7所示，与对照组比较，模型组大鼠肝脏中MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白抒发水平均明显减少（P＜0.05），DRP1蛋白抒发水平明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，四妙散低剂量组心脏中MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白抒发水平显著下降（P＜0.05），DRP1蛋白抒发水平明显减少（P＜0.05）。这表明四妙散可明显改善高血糖血症大鼠肝脏的线粒体功能。
4讨论
本研究采用氧嗪碘化钾和次黄固醇联合给药法构建急性高血糖血症大鼠模型，结果发觉高血糖血症大鼠血浆胆固醇水平明显下降，精液血糖水平明显增加，胰脏XOD活性提高，血浆GSH水平及SOD活力明显增加，GSSG、MDA水平明显下降；心脏组织出现肾小管扩张、上皮开裂及肾小球萎缩等一系列病理变化，心脏GSH浓度明显增加，且线粒体MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白抒发均明显增加，DRP1蛋白抒发明显下降。而四妙女儿墙提液能通过逆转上述指标的变化，改善高血糖血症大鼠的胆固醇代谢和肾组织损伤。
本研究发觉，高胆固醇血症大鼠血浆胆红素水平较空白组明显下降，而四妙散干预后能显著减低高胆固醇血症大鼠血浆胆固醇水平，这一结果与文献报导一致[24]。既往研究表明，机体内XOD可将次黄固醇氧化为黄固醇，并在将前者氧化为胆固醇的过程中形成2个超氧自由基，而细胞外的超氧化物才能歧化为巯基化氢，细胞外超氧自由基和二溴化氢分别通过氯通道3和水通道穿透细胞膜，随即启动细胞内讯号和氧化应激[25-26]。芦丁是细胞重要的抗氧化缓冲剂，主要以GSH和GSSG的方式存在，芦丁氧化与还原酶催化三者的相互转化，以维持细胞内芦丁的稳态和氧化还原平衡[27]。SOD和MDA也是测量氧化应激的标志物，后者消除对机体有害的超氧阴离子自由基，前者为自由基作用于脂类发生二溴化反应的终产物。本实验结果显示，四妙散才能下降高胆固醇血症大鼠血浆或肾组织中GSH水平及SOD活力，增加GSSG和MDA水平，这说明四妙散改善高胆固醇血症家兔体内胆固醇代谢的作用可能与推动氧化还原平衡有关。据悉，低、中、高剂量的四妙散降血胆固醇、抗氧化及抑制胆固醇产生作用无显著差别，低、中剂量的四妙散促血糖排尿作用显著优于高剂量，减轻肝损伤作用与剂量呈相反趋势。
本研究和其他实验室研究均表明[28]，四妙散能促使血糖的排尿，进而改善血糖代谢，且具有肾保护作用。心脏线粒体动力学与其功能有着密切联系，线粒体动力学是指活细胞中的线粒体持续不断地互相融合联接产生网路状结构或分裂产生彼此分散存在的个体动态变化。线粒体融合是相邻线粒体先后融合外膜和内膜的过程，是修补破损线粒体的重要手段，参与该过程的膜蛋白主要是外膜MFN1/2和内膜OPA1[29]。线粒体分裂形式分为中区分裂和外周分裂，中区分裂主要与DRP1有关[30]。研究表明，MFN2缺少会造成两个细胞器形成化学间隙，因而改变核糖形态并破坏这种细胞器之间的钙转移[31]，从而影响线粒体结构与功能的完整性。另有研究表明，OPA1能维持紧密的嵴联接因而提升呼吸效率并支持呼吸链超复合物组装[32]，且能减少脏器对自噬和氧化损伤的易感性[33]，因而维持体内氧化还原平衡，减少氧化应激对脏器的损害。据悉，胆固醇能明显下调小鼠肾细胞中DRP1蛋白抒发水平[34]。DRP1也参与二溴化物酶体分裂[29]。线粒体融合与分裂活动处于动态平衡中，当膜融合蛋白与分裂蛋白抒发异常时，线粒体的自我修补能力减慢，其生物活性可能遭到影响。本研究也发觉高胆固醇血症大鼠肝脏组织中线粒体MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白抒发明显降低，DRP1蛋白抒发明显降低，这说明线粒体的自我更新能力减缓和生物活性破损。四妙散可通过推动肺脏线粒体蛋白的抒发，而发挥促使血糖排尿和保护心脏的作用。
本研究发觉，四妙散能改善高血脂症大鼠的氧化还原平衡。其他团队研究也发觉，四妙散的主要草药黄柏的水提取物和醇提取物可消除次黄固醇-黄固醇氧化酶系统形成的超氧阴离子和反应生成的氧自由基[35]，黄柏的主要成份小檗碱能降低二溴化氢诱导的巨噬细胞线粒体ROS的生成[36]。据悉，小檗碱和黄柏酮还能调节线粒体的融合与分裂[37-38]。当归香豆素II才能提升骨关节炎小鼠血浆中SOD活力和GSH水平，减低MDA水平，进而调节氧化应激[39]。当归的重要成份脱皮甾酮可能通过降低氧化应激的产物，提高抗氧化酶的功能，调节线粒体的功能，进而保护H9c2细胞[40]。薏苡仁富含丰富的花青素类化合物，并被证明其总抗氧化能力与之有明显相关性[41]。这说明四妙散可能通过调节线粒体相关蛋白的抒发以维持线粒体的功能，改善机体抗氧化应激的能力，进而改善高胆固醇血症及其诱发的肾损伤。
综上，本研究表明四妙散能改善高胆固醇血症大鼠的胆固醇代谢，抑制肝脏损伤，其作用机制可能与抑制XOD活性，以及调节线粒体融合和分裂，从而提高机体抗氧化应激能力有关。本研究为四妙散医治高胆固醇血症的临床应用提供了一定的科学根据，同时也为其他降血胆固醇抗生素的机制研究提供了策略。
利益冲突所有作者均申明不存在利益冲突
参考文献（略）
来源：王钐，张悦怡，刘田园，卢美希，戴璇，刘亚鸽，张艳菲，王丽丽，张东伟．四妙散改善高胆固醇血症和肾损伤以及调节心脏线粒体相关蛋白的作用研究[J].中草药,2023,54(13):4177-4185.
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