摘要：
背景和目的近些年来一些病例报告显示:患有根尖周炎或根尖囊肿的年青牙齿,经诊治后牙齿尖持续发育成型。传统观点觉得:根尖周炎伴发脓肿及根尖透射影像,骨膜活力测试阳性时牙冠已全部坏死,牙齿将停止发育,其实,传统知识难于解释此现象。学者推断根管内及附近组织中一定还存在能促进牙齿继续发育成型的诱因。由此提出"血管重建"假说,并觉得:年青牙齿厚实的根尖提供了从根皱襞到根尖周组织的良好通路,当仅有部份牙冠感染时,可能引起根尖周癌症;但是因为通畅的血液循环,骨膜和根尖乳房中的干细胞似乎仍存活于有感染的组织中,并可发生牙周再生及根尖成型。2006年,[8]从阻生臼齿的根尖乳房中分离得到具有高度增殖能力和多向分化潜能的干细胞,将其命名为根尖乳房干细胞(stemcellsfrom,SCAP)。研究表明,与牙周干细胞相比(pulpstemcells,DPSCs),SCAP表现出更高的溴脱氧尿苷吸焦比,数目倍增能力,更强的细胞迁移能力以及更多的细胞阴性抒发STRO-1(间充质干细胞表面标志)。SCAP经成骨,成脂和神经方向诱导后,具有向成骨细胞,脂肪细胞和神经细胞分化的能力。
体外扩增的SCAP以甲基磷灰石/乙酸三钙(/,HA/TCP)为载体,在免疫缺陷大鼠体内能产生骨膜牙本质样复合体。Huang以聚乙丙交酯(poly-D,L-and,PLG)为载体,将SCAP接种于载体上,借助根管片断模型进行骨膜再生的实验,结果显示除了有含血管的牙冠样组织生成,更重要的是,原有牙本质和MTA表面有一层连续均匀的牙本质样组织生成。表明人SCAP分化为成牙本质样细胞后,从而产生牙本质。患有根尖周炎或根尖囊肿的年青牙齿中存活的SCAP可能具有促进肿瘤根尖周组织继续发育成型的作用。喂奶植物的牙齿发育是一个常年的过程,包括牙齿发育启动,牙齿延长并完善鼻窦附着关系,臼齿萌出直到咬合关系构建,最后牙齿发育完成,根尖孔闭合。在这一过程中,牙齿进一步发育同时伴有牙髓组织产生及鼻窦附着的完善,进而使牙齿及牙髓组织产生一个功能单位被锚定在颌骨上。牙齿及牙髓组织共同的发育依赖于发育期牙齿的根端组织持续增殖并分化。在结构上,发育期牙齿的根端组织包含单层上皮细胞构成的鞘样结构,即上皮根鞘('sroot,HERS),上皮根鞘将其下方的外胚间充质组织界定为牙乳房及牙囊。
往年的研究表明牙囊可分化产生鼻窦膜,牙骨质和牙槽骨等牙髓组织,而牙乳房产生牙本质及牙周,上皮根鞘则作为牙齿产生的诱导者和调节者,调节牙齿大小细胞膜片,形状和牙齿数。学者发觉调节牙齿及鼻窦组织发育的讯号分子,如BMP,同源异形盒基因家族Msx和Shh,FGF,GDF均定位于发育期的根端组织。猜想可能通过细胞-细胞及细胞-基质间的互相作用并由此形成的讯号分子使牙齿和鼻窦组织产生细胞的前体细胞分化,因而促使牙齿和鼻窦组织的形态发生。臼齿萌出前,牙囊包围着成釉器与牙乳房组织。但是在牙根萌出后,牙囊仅稳居发育期牙齿根端,与牙乳房相连,两种组织间丧失了牙胚发育初期所存在的组织学分界。考虑到牙齿,牙髓组织在发育上的同步性以及两者功能上的完整性,学者将发育期的牙齿根端组织命名为"根端发育复合体"(,DAC)。学者将SD小鼠DAC与陶瓷化骨混和后,移植到小鼠肾包膜下细胞膜片,4W后可见牙本质,牙骨质,鼻窦膜及骨样组织产生。由此推断DAC在牙齿发育时期,除了继续产生牙齿,同时也产生牙髓组织,以完善结构完整的牙齿/鼻窦复合体,因而行使吞咽功能。学者借助大型猪植物模型,眼科放疗清除牙齿发育早期的牙乳房后,虽然骨膜组织完整,但牙齿停止发育;相比之下,富含牙乳房的其它牙齿生长和发育均正常。
由此推断牙乳房在牙齿发育中起着重要作用。牙乳房作为"根端发育复合体"的一部份,其单独作用,是否也能产生牙髓组织呢?本课题从人未发育完全的年青牙齿中分离培养SCAP和鼻窦膜干细胞(stemcells,),并分别测定其克隆产生率,细胞增殖能力,并于体外诱导培养条件下,观察其矿化和向脂肪细胞分化的能力,以及测定其在体外是否抒发鼻窦膜相关标志,观察SCAP在体外是否表现鼻窦特点。致力探求来自发育中组织的SCAP,是否与根尖区牙髓组织的产生有密切联系,为牙齿及牙髓组织共同发育机制提供一定的根据。方式1,SCAP与的搜集和培养选定16-20岁健康病人牙齿未发育完全(牙齿发育2/3)的阻生臼齿,根据等的实验方式,采用组织贴块法培养细胞。将从同一颗牙切取的牙乳房组织和鼻窦膜组织充分剪碎后接种于细胞培养瓶内培养。2,免疫萤光测量干细胞表面标志STRO-1分别取第1代的两种干细胞,用免疫萤光法测量两种干细胞是否抒发干细胞表面标志STRO-1。3,SCAP与(?)细胞克隆产生实验在6孔板中按200个细胞/孔的密度分别接种第1代的两种干细胞,连续培养10d后,结晶紫染色观察细胞克隆数。
4,SCAP与生长曲线的测定分别取第2代SCAP和的单细胞悬液,MTT法测各孔OD值,连续测8天,以时间为纵轴,每晚的平均OD值为横轴勾画生长曲线。5,SCAP与的矿化能力取第3代两类干细胞,在矿化诱导液中分别诱导7d,14d和21d后,茜素红染色观察矿化团块产生情况,免疫萤光染色法测量矿化相关标志物ALP,BSP和OC的抒发情况,以及萤光定量PCR测量这三种标志物在两种干细胞中的抒发差别。两类干细胞在普通培养基中培养60d后,茜素红染色观察钙囊肿产生情况以及萤光定量PCR测量矿化相关标志物在两种干细胞中的抒发差别。6,SCAP与的成脂诱导分化取第3代两类干细胞,在成脂诱导液中分别诱导21d后,油红O染色观察脂滴产生情况。7,SCAP与细胞膜片的制备取第3代两类干细胞,在含维生素C的诱导液中诱导14d后,光镜下观察细胞外基质产生情况。剥离细胞膜片,制成石蜡切块,HE染色观察细胞膜片形态。8,RT-PCR检查SCAP与的鼻窦膜标志物分别取两类干细胞的第3,5,7,9代,RT-PCR检查鼻窦膜标志物和。
9,经矿化诱导后的变化萤光定量PCR检查SCAP与在矿化诱导培养基中培养21d后,与诱导前的变化。10,统计学处理采用。0统计软件数据进行两个样本t检验,结果以均数±标准差(X±S)表示,p0。05表示差别有明显意义。结果1,细胞形态及生长情况细胞约5-7d从组织块周围爬出,两种细胞形态相像,均呈短梭,多角形。传代后细胞呈成纤维细胞形态,细胞大小和形态趋近一致。2,免疫萤光检查干细胞表面标志STRO-1第1代SCAP和均阴性抒发STRO-1。3,SCAP与细胞克隆产生实验SCAP和均能产生克隆细胞团,SCAP产生的克隆数低于4,SCAP与生长曲线的测定两种干细胞在第3天步入对数生长期,SCAP的增殖活力显著强于。5SCAP与的矿化能力两种干细胞经成骨诱导后,细胞复层生长,集聚成簇,茜素红染色均可见钙囊肿产生,随着诱导时间降低,钙囊肿逐步增多。免疫萤光显示两种干细胞均阴性抒发矿化相关标志物ALP,BSP和OC,萤光定量PCR显示这三种标志物在SCAP中的抒发均低于。
细胞在普通培养基中培养60d后,茜素红染色均阴性,且SCAP中ALP,BSP和OC的基因抒发均低于。6,SCAP与的成脂诱导分化SCAP和在成脂诱导体系的作用下,21d左右可见细胞中出现串珠样透明高色温点,并有部份融合,油红-O染色呈阴性。7,SCAP与细胞膜片的产生SCAP和经诱导14d后,大量细胞外基质产生,成熟膜片产生,组织学检测显示两种膜片较为均匀,细胞间含有大量的细胞外基质。8,RT-PCR检查:SCAP与的鼻窦膜标志物RT-PCR显示第3,5,7,9代的两种干细胞均抒发鼻窦膜标志物和。9,经矿化诱导后的变化经矿化诱导后,在SCAP和抒发均升高。推论本实验成功分离培养SCAP与,两种细胞具有干细胞特点,抒发干细胞表面标志物,且具有矿化,成脂分化的能力。SCAP的克隆产生能力,细胞增殖能力和矿化能力均低于。与一样,SCAP也抒发鼻窦膜相关标志物,否认SCAP在体外表现鼻窦特点。SCAP也许可作为组织工程鼻窦再生的干细胞来源。
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