【摘要】：目的:初步观察不同钛表面小鼠成骨细胞膜片的成骨效应,以期剖析细胞膜片骨组织工程技术与钛表面改性的联合运用是否能对钛养殖体骨整合界面的产生具有显著的推动作用。方式:取24h新生SD小鼠头颅体外分离、提取原代细胞,培养传至第3代,定期观察细胞形态并通过苏木精—伊红(-eosin,HE)染色、碱性乙酸酶(,ALP)染色、茜素红(red,ARS)染色、I型胶原免疫组化染色鉴别成骨细胞。静态水接触角测试不同钛表面润湿性;电镜扫面(SEM)观察不同钛表面形貌特点及负载细胞后生长特点;再将已鉴别的第三代成骨细胞以0./ml密度接种于不同表面钛片上制备成骨细胞膜片,定期观察膜片形态并采用ALP活性测试膜片分化;通过实时萤光定量PCR(RT-qPCR)及免疫蛋白印记法()测量OPN,OPG,RANKL成骨标志性因子基因及蛋白的抒发水平;将体外培养14天的成骨细胞膜片植入裸鼠皮下,分别于术后第8周、16周取出植入物行HE染色、染色和I型胶原免疫组化染色,评价在不同钛表面成骨细胞膜片体内异位成骨的能力。
结果:原代细胞经培养及鉴别,细胞形态学复合成骨细胞特点;三种钛表面静态水接触角均呈小于5°,大于90°,呈亲水性表面(大于5°为超亲水性,小于90°为疏水性,介于5°-90°之间为亲水性),实验组较对照组更接近超亲水性,而实验组之间比较无明显差别(P0.05);电镜扫描显示机械抛光组表面较光滑,成骨细胞附着生长不连续,基质衔接有破裂且多为双层生长;阳极氧化组表面产生较为整齐均匀的多孔阵列结构,细胞生长密集有序,基质延孔边沿联接、爬行;喷丸酸蚀组表面产生“蜂窝状”多级多孔,凸凹不平,细胞黏附后呈三维方向叠层生长;ALP检查,各时间点,实验组活性均低于对照组(P0.05),实验组之间ALP活性抒发无明显差别(P0.05);各组成骨细胞膜片在第14天ALP活性均高于第7天(P0.05)。RT-qPCR及blot检查:组间比较,实验组中细胞膜片OPN、OPGmRNA和蛋白的抒发量在各时间点均低于对照组(P0.05),实验组之间比较在各时间点均无明显差别(P0.05);组内比较,实验组及对照组OPN、OPGmRNA和蛋白从第7天到第14天呈下调趋势(实验组及对照组和蛋白:P0.05,对照组OPGmRNA及蛋白:P0.05,实验组OPGmRNA及蛋白:P0.05);不同钛表面对RANKLmRNA及蛋白的抒发没有明显影响(P0.05)。
体内异位成骨实验染色结果显示细胞膜片,在第8周对照组无法产生骨样基质,实验组均能产生骨样基质,但实验组间差别不显著;第16周,三组均能产生类骨样组织,可见成骨组织相关结构,相比对照组,实验组形态及成熟度相对更佳,实验组之间比较,综合三种染色剖析,阳极氧化组及喷丸酸蚀组产生骨组织无显著差别。推论:(1)相比机械抛光表面细胞膜片,小鼠成骨细胞膜片在阳极氧化及喷丸酸蚀钛表面具有更佳的成骨效应,阳极氧化与喷丸酸蚀组间差别无明显性。(2)钛表面小鼠成骨细胞膜片成骨效应的调控可能主要通过影响OPG的抒发来实现,对RANKL的影响不明显。(3)阳极氧化及喷丸酸蚀表面成骨细胞膜片在8周时可见骨样基质产生,机械抛光组膜片未见骨样基质,在16周后均能在体内产生骨组织。
