【摘要】：目的:喂奶植物的卵子在步入男性生殖道后,需穿过子宫,继续运动到卵巢、输卵管,直到找到精子完成受孕。在这个过程中周围环境的渗透压逐渐增长,低渗启动了精液一系列的讯号转导。既往有关受孕过程中伴随时不同位置的渗透压增加的研究主要关注于精液的容量调节性降低,未有学者系统地研究精液在外环境渗透压升高时的讯号转导通路。本课题以低渗改变时人精液讯号转导通路为研究对象,阐述钾离子通道KCNQ1/KCNE1在低渗变化时作用钠离子钾离子通道阻滞剂,诠释外环境渗透压改变对人精液的生理意义,并进一步推论低渗下精液的讯号转导与部份女性不育症发生的联系。方式与结果:本课题按研究次序分为五个部份。第一部份,目前还没有研究否认人精液膜上有KCNQ1/KCNE1通道,因而,否认它的在人精液膜上的存在是本研究的第一步。借助RT-PCR、WB、IP、等方式我们从RNA水平和蛋白水平鉴别KCNQ1/KCNE1在人精液中存在与定位,否认了KCNQ1/KCNE1在人精液膜上的存在;第二部份,细胞内外渗透压是影响细胞内外水平衡的重要诱因,当细胞处于低渗环境时,细胞内水降低,细胞膨胀,与此同时,细胞启动容量调节机制,代偿性离子转运机制的激活使细胞内的离子外流,因而使细胞内的渗透压升高,细胞内的水外流,细胞体渐渐恢复,这个过程称为调节性细胞容量增长(RVD)。
精液的RVD过程主要由钾离子通道、氯离子通道、水通道参与。我们采用流式细胞术(FCM)测量精液容积、钾离子萤光探针测量精液胞内钾离子含量的实验方式,借助钾离子通道KCNQ1/KCNE1特异性抑制剂色原醇293B否认了KCNQ1/KCNE1在人精液在低渗状态下的通道处于开放状态,介导钾离子外流,导致精液的细胞容量降低;第三部份,为了明晰生理智的渗透压升高对精液的意义,我们从精液的运动、形态、胞内钙离子含量的改变角度剖析低渗对精液的影响,实验结果否认精液的直线运动速度增长,卷尾率降低,否认了低渗对步入女人生殖道的精液有筛选作用。通过特异性抑制剂色原醇293B,我们发觉当KCNQ1/KCNE1通道被阻滞时,精液参数变化更显著钠离子钾离子通道阻滞剂,这意味着低渗时钾离子通道KCNQ1/KCNE1通道的开放才能帮助精液对抗低渗导致的对活力不利的影响。钙成像的结果显示胞内钙离子含量在低渗时上升,进一步通过胞外钙螯糖浆的作用,我们发觉胞内降低的钙离子主要来自于精液内的钙库。第四部份,在明晰了钾离子通道在人精液低渗改变时开放的作用后,为了找寻该通道的上游调节机制,我们测量了人精液膜磷脂酰肌酰-4,5-二乙酸盐(PIP2)在低渗时的变化。
PIP2在低渗时变现为先增长后上升,提示了在低渗应激初期PIP2的酯化占主导地位,这与磷脂酶PLC的激活相关。用PLC阻滞剂预处理精液后,精液胞内的钙离子和钾离子含量不发生变化。这种结果提示在低渗应激时PLC被激活,酯化PIP2生成三乙酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG),IP3通过IP3受体激活了精液内钙库RNE释放内钙,导致胞内钙离子含量降低。形成的DAG则可能通过激活蛋白激酶PKC导致KCNQ1/KCNE1通道的开放,介导低渗时胞内钾离子的外流。第五部份,为了进一步从电生理水平否认钾离子通道KCNQ1/KCNE1的低渗条件下的开放与PLC-PIP2-IP3/DAG通路相关,我们在HEK细胞上建立钾离子通道KCNQ1/KCNE1模型,借助膜片钳技术,否认了KCNQ1/KCNE1在低渗下的开放,而PLC抑制剂对低渗导致的钾离子通道KCNQ1/KCNE1的开放起抑制作用。推论:人精液在低渗状态下会激活细胞膜上的磷脂讯号转导系统,钾离子通道KCNQ1/KCNE1的开放则与PLC的激活相关,KCNQ1/KCNE1开放后钾离子外流可降低细胞容量,对抗低渗对精液活力的不利影响,而在此过程中钙库释放的钙离子也为精液的获能提供了离子基础。