ABC—ELISA方式测量细胞表面IgGFc受体中国免瘦学刊物方式测量细胞膜表面IgGFc段受体(第二军医学院长征诊所外科,广州)(擒要]为开辟更具实用价值的Fc受体研究的新途径,~EEL[SA方式基础上引~,ABC技术。检查细胞表]段受体。fflJt物素直接标记吡啶,与胞膜相应受体结合后再连结ABC复合物,敏感性大大增强,PN以上,D—N值达0。8左右。(关键词]ELISA;ABC法|IgG受体能够用酶免疫技术研究离体细胞表面受体是一个正在尝试的问题。等:1]曾报告用ELISA方式测定细胞表面AFc段受体,敏感性不高。本研究在ELINA方式基础上,引入ABc(——)技术,检查Nama}wa细胞表面IgGFc段受体(F0R),敏感性和特异性均有所提升。材料与技巧,材料1。细胞:北京生物制品研究所提供。2。培养基G_blo产品。3。活化生物素(BNHS)及ABC复合物'北京陆军医学研究所程振球副研究员惠赠。4。热汇聚IgG(AHG):按方式制备[2,5。
明胶:Difc0产品。6。度二醛:北京物理试剂厂生产。7。40孔热固性乙烯酶标板:广州塑胶;648。型酶联免疫检潞仪:南京华东电子管厂生产。二,方式1。生物素标I~AHG[{溶于0。5mI二苯基甲丙酯中AHG用pH9。0细胞膜受体,0。稀释成2mg/mI,按BNHS游离胺基克分子比值()为2:1。将上述两碱液混和,置252h,对pH7。2PBS,4透析24次,搜集生物索化AHG,并调整蛋白含量为2mg/ml,加等容积甘油,一20保存,备用。2。细胞培养}培养基由,含l0灭活小牛血浆,抗生素10ou/mI,链霉索,2mmol,LL一谷氨酰睦构成。细胞接种于上述培养基,细胞数为。置3"c,5CO孵箱培养,一天传代一次3。细胞FcYR{1)碱液配制:封闭液为5明胶PBS;稀释明胶PBsI漂洗液为0。5明胶PBs|邻苯二胺底物缓冲液为乙酸氢二钠2。84g,葡萄柚酸2。1g加分馏水至l0000mI。上述滤液均经高压杀菌。(2)酶标板预处理:新购40小时,甩干,紫外线照射30min。
(细胞包板:取对数生长期Na-malwa细胞用Hanks淡,计数并用台盼蓝染色,活细胞数小于95,用Hanks液配成1106/mI细胞悬液。取经瑗处理过的40复孔为测定孔,CD为竞争抑制阳性对照孔。置板于特制离心定子上,离心,,3min大速率至,l0min。轻轻取出酶标板,置37孵箱20min,每孔舟n甩干。(4)封闭:每孔加封闭液250l,置372h或4过夜。用漂洗液洗两次。()受体一官能团结合:梗f定孔加生物素化,含量为5OgmI(用稀释涟稀释),阳性孔跺含50ug/mI生物素化AHG外,尚含200度AHG,总数亦为5OI'。置,洗;次,每次3min。(6)连结ABC复合物:ABC复合物按1:200稀释,每孔加50l,37温育20min,洗5(7)显色,中止反应及测定OD值:4mg二胺溶化于l0ml底物缓冲液,加,混匀,每孔加5Ol,3孢保温min后加2mol,L,—ELIsA测定法试验条件确定1。细胞包板条件:(1)离心速率为1800—时可使细胞与酶标板良好吸附,高于疗效不佳I(2)戊二醛固定酿度在0。
2以下,2以上,oD值显著增加,固定时间大于,小于90min,oD值亦显着增加。含量为0。5,周定时间左右,疗效最佳。2。明肢封闭非特异性吸附和结合位点的疗效:用不同含量明肢封板,但是1O小牛血清白蛋白(BSA)及PBS作对照,结果明腔液度在5以上时,非特异吸附和非特异结合部份的oD值最低,与IOBSA封闭疗效相像。3。生物素化AHG与细胞温育时间:AHG胞分别温育30,45,60,7,5,,结果表明,温育,其特异性结台部份的OD之差达最高值。4。生物素化AHG稀释液的PH值和离子硬度对非特异性吸附的影响:在PH值的稀释液,及PH值固定为7。2。改变NaCI含量设3种离子硬度的稀释液,结果以PH7。2,0。/LpBS的明胺稀释液最理想。5。酶工作含量选择:ABC复台物含量高,OD值亦降低,当ABC复合物稀释度为1:200值在0。2左右,P—N值最大。二,方式考评1。竞争抑制试验:生物素化AHG含量固定为50ug/ml,用不同含量AHG与之竞争细胞膜结合位点,当AHG含量为生物素化AHG5倍时,竞争抑制率达O以上,100倍时可达到完全抑制。
若以LOBSA作为无关蛋白取代AHG,则无竞争抑制作用。2。饱和试验:其它条件固定,生物素化AHGbk低含量蓬渐加强,至50g/ml时受体与官能团结合达到饱和(见图1)。3。包板细胞数与OD值的关系:图2细胞数在L10?一1105范围内,OD值呈直线上升,小于L105则不呈直线关系。其它实验项日中,细胞数均为l105/孔。4。方式的精确性:在同一时间内测定LO份细胞标本,确定批内变异系数;在两周内测定不同传代旋数细胞标本,求批同变异系数。结果分别为3。49。1。讨论FcR测定方式好多,最常用也是最精典的方式是EA玫瑰花环法4但该方式打算和操作过程均较复杂,条件不易控制,易受主观诱因影响,结果判断不统一及不能作受体定量。放射免疫测定法填补了EA玫瑰花环法的部份不足,它是一种定量受体剖析法[5{可以测定细胞表面Fc受体的平均数目及亲和力。但它通常只艟用于测量高亲和力FcvR,即FcYRI,还存在着技术要求高,核素污染等问题。免疫萤光技术测定Fc[q性较EA花环法大大提升,但车法免疫肆蛋白消耗量大,结果判定亦受主观诱因影响。近些年来,依据包板细胞敷与oD值的关系'Il?免疫萤光法的原理发展上去的受体藏式细胞计数剖析法是一项精史技术:"。
,它除了可以直接测定Fc受体阴性细胞的百分比,且可依照萤光硬度进行受体定量剖析。但流式细胞计数仪非常高昂。难推广综上所述,Fc受体的测量方式其实好多,世各有优劣点,可以互相补充,但大多不能互相替代。据此,我们有可能针对所需解决的某娄问题,选择某种或某几种合适的方式进行Fc受体的研究。本研究致力开辟一种更具实用价值的Fc受体研究的新选径一酶免疫受体剖析法。据于1985中报告,用IsA与已包被于热固性乙烯板上的细胞株温育,用底物显色后以OD值表示受体的有无和多寡,能反映IgA受体的存在,但敏感度不高。每孔x105个细胞显色后OD值虽高不超过0。20,且因为引凡的酶标抗原其自身Fc段(尤其是这些第二抗原为鸟类IgG时)亦有可能与膜上Fc受体结台。故不适用于其它细胞膜受体的研究。我们用生物素直接标记配基,与胞膜相应受体结台后再连结ABC复合物,敏感性大大增强,PN值可达4PN值达0。8左右。而且还适用于其它膜表面受体研究细胞是人类B淋巴精细胞株,抒发低亲和FvR,即,漂浮生长,离心后可疏松地贴附在热固性乙烯板上,一定含量戊二醛可固定细胞于酶标板,同时固定受体于细胞膜表面实验结果显示,戊二醛含量偏低,细胞未被完垒固定在板上,显微镜下见大多敬细胞被洗掉,含量过低及固定时间过长则影响AHG与Fc受体结合,可这能是因为戊二醛改变了受体的氢键。
阻挠受体对官能团的辨识和结合为此我们选择r能使细胞完全固定于酶标板而又不影响受体官能团结合的戊二醛含量及固定时间ELISA技术中,解决非特异性吸附问题最为困难,常为此而影响实验结果判定。本实验与普通ELISA术不同之娅在于尚存在细胞膜表面非特异性结台的问题概括上去有五个部份:1:标记络合物与酶标板非特异性吸附2-:标记络合物与细胞膜上"无关蛋白"非特异结台}3)ABC源性生物素与ABC复台物中亲生物素蛋白非特异性结合;/5)内源性二溴化物酶的非特异性显色。多次宴验结果表明,后三娄非特异性反应值较小,总old值不超过0。05为有效地减少前两类N们采用综合举措细胞膜受体,取得满意疗效。首先。在生物素标AHG时。选择适当的BNHS/FAG值。使敏感性较高而N值较低;其次用优质明胶封闭非特异件结台位点,并在稀释液和漂洗液中均配以一定含量明胶。除了封闭疗效好,且经济实用。曾尝试在漂洗液中加^0。05l',结果N值反倒增高,原因不详推论可能与降低了标记AHG与细胞膜成份的非特异结台有关第三,选择台适的缓冲液的pH值的离于硬度:第四,选用台适的ABC工作含量。
另外,控制各步骤反应时间,如ABC复台物与标记AHG的反映时间不超过20有效地减少N值【8j在封闭非特异性吸附和结台位点实验中发觉,虽然因封闭形式不同,N值不一,但PN为衡定。P—N值代表了受体与官能团的特异性结合值。故我们借此差值而不是以PN比值来反映受体浓度,这样虽然N值较高亦不影响结果判断,本方式是一种半定量Fc受体剖析法,它能反映细胞群体FcvR的浓度,但不能对群体中抒发FYR的细胞数进行定量,也不能明晰分辨被测量的FcYR类型。但是,与EA玫瑰花环法和免疫萤光法比较本法具有简捷,敏感,结果判定不受主观诱因干扰等优点。与放射免疫法相比,本法毋须重复标记配体,一次标记的生物素化AHG可使用三年左右,且无放射性物质污染之嚷,亦无需特殊仪器设备总之,我们觉得,FcYR的测量法具有简便,易行,可靠,敏感,实用等特性。值得进步研究和推广。(本研究曾得到北京陆军医学研究所流行病研究室程振球副研究员的热情帮助,在此表示谢谢)。参考文献『Jim巾『。85:269。2。,ihL洲,1~611,85【633。,eta『。JH】1978,27:儿31,eta【。ScIe『。1967,158t5,eta【,1974,【9IIII756Dick『erHB,Kunke【HG。,t976,