-(APCs)forTumor-in
你们好，明天给你们带来一篇2021年发表在AngewChemIntEdEngl的文章，作者来自于陆军军医学院盛春泉课题组，题目为“-(APCs)forTumor-in”。研究人员开发了一种新型策略--共轭方式，以提升传统的癌症特异性靶点能力和体内抗肺癌效力。
背景介绍
蛋白酯化靶点嵌合体（）的开发正在成为一种前景宽广的靶点蛋白降解策略。但是，因为膜渗透性差、体内药效低和分布不均等诱因，使用异多功能分子进行抗生素开发普遍遭到限制。在此，研究人员开发了一种新型策略--共轭方式，以提升传统的癌症特异性靶点能力和体内抗肺癌效力。
作为概念验证，通过可裂解联接体将BET靶点与核苷酸适配体（AS）共轭，设计出了第一个适配体-共轭物（APC）。与未修饰的BET相比，所设计的分子（APR）在MCF7异种移植模型中显示出更强的癌症靶点能力，因而提高了体内BET降解和抗肺癌效力，并增加了毒性。为此，APC策略可为设计病变特异性靶点铺平公路，并在基于的抗生素开发中具有广泛的应用前景。
数据剖析
第一种-共轭物（APC）是通过用AS和可裂解联接体修饰溴代主外膜（BET）而合理设计下来的。该共轭物对抒发碱基的MCF7甲状腺癌细胞中的BET降解具有极好的特异性和强效作用。该APC的优势还彰显在其出众的体内病变靶点能力、强大的抗肺癌效果以及降低对脏器的副作用。
APC策略可以改善传统的水溶性、肿瘤靶点能力和抗肺癌效果，为克服其缺点提供了一种有价值的工具。
方案一:试剂和条件:a)二苯基-4-氧代-3,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十六烷-16-酸，DIPEA，DMFrt，3h，产率75%。B)，DCM，rt，6h，产率82%。C)8(辅助资料计划S1)，DIPEA海图，DMF，rt，12小时，利润率70%。4-甲基吡啶氯甲酮类，DMAP，DCM，rt，12h，产率65%。E)2,2’-二磺酰二(苯酚)，DMAP，DCM，rt，8h，产率68%。F)丁二羧酸，DMAP，dCM，rt，3h，产率85%。G)适体，Sulfo-NHS，EDCI，dd-H2O，DMF，0.5M/,12小时，丰度40-70%。
BET家族蛋白（BRD2、BRD3、BRD4和BRDT）是关键的表观遗传调节因子，可选择性地辨识并结合甲基化组蛋白，进而将染色质转化为适宜通过RNA聚合酶II（PolII）进行转录延展的氢键。
因为BET的数据非常可靠，因而一般被用作机理研究和方式开发的标准平台。尤其是（下文中称为化合物4，PRO；方案1）已被普遍用作模板分子，用于开发新的递送策略。为此，试验者选择了强效BET（BRD4）降解剂PRO和核醇依赖性适配体AS进行APC概念验证研究（图1a）。
必须保持明晰的分子结构，能够与目标蛋白和E3泛素酶产生三元复合物。为此，PRO结构中的联接位点对APCs的设计尤为重要，APCs应能靶点输送到癌症细胞，然后通过分离联接体释放出原始PRO分子。PRO的结构剖析表明，VHL官能团富含一个游离胺基，这为引入联接体和AS提供合适的附着位点
值得注意的是，这个甲基对于VHL的结合至关重要，在这个位置联接联接子和适配体将阻断PRO的降解活性。因而，试验者设计了一种酯基二硫联接体，以确保PRO在细胞内的释放（图1b）。首先，AS可被抒发同位素的病变细胞选择性辨识。最后，新产生的游离胺类可功击碳酐酯键，释放出PRO分子。
为了评估所设计的APC（化合物APR）的分布、稳定性和抗肺癌活性，还设计了一系列对照分子（图1b）。我们选择了代表非特异性DNA序列的胞吡啶寡核苷酸序列(CRO)作为AS的对照。设计的萤光素酰（读“先”）胺（Fam）或吡啶3（Cy3）修饰可用于观察共轭物的特异性靶点。
图1.a)APC设计策略示意图。APC的部份可选择性地辨识细胞膜受体，并被病变细胞特异性地吸收。b)APC、成像分子和阳性对照的物理结构和设计原理。
AS的稳定性（图2a）:
通过10%聚丙烯丙酯凝胶电泳（PAGE）评估了APR的稳定性。将ASCy3和放在含10%胎牛血浆（FBS）的培养基中，在37-38摄氏度下培养不同时间。与ASCy3一样，在含血浆培养基中培养48小时后表现出稳定的特性。几乎以完整的方式存在，这意味着用分子对AS进行末端修饰不会增加其稳定性。
验证PRO是否能从APR中有效释放:
作者构建了一种高效气相色谱检查方式，以评估PRO在还原条件（0.01M二硫苏糖醇（DTT）在1×PBS缓冲液中，pH7.4，0.5%w/vTween80）下于378C的体外释放情况（图2b）。随着孵育时间的延长，APR释放的游离PRO量也在降低。因而，测量到的APR峰的硬度增加了，而测量到的PRO峰的硬度降低了（图2）。PRO和峰值降低，这意味着在还原条件下，PRO成功地从APR体外释放。
验证MCF7细胞对APR的摄入和内化:
使用Cy3或共轭物进行了流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜检查。AS特异性靶点细胞膜定位的同位素，同位素在MCF7卵巢癌细胞中过抒发，但在（正常人卵巢上皮细胞）细胞中没有抒发。首先，流式细胞剖析表明，与MCF7细胞培养后，ASFam和的细胞摄入效率远远低于非选择性的和结合物（图2c）。相比之下，与对照细胞培养后，未观察到Famm修饰的靶向寡核苷酸与非靶向寡核酸的萤光硬度有差别。这种结果否认了可被MCF7细胞特异性辨识。此后，我们通过激光共聚焦扫描显微镜阐述了APR的摄入和特异性。在用DAPI染色前，先用APRCy3、ASCy3和处理MCF7细胞1小时（也测量了样品）。
图2d显示，用或ASCy3培养的细胞比用培养的细胞显示出更强的蓝色萤光。这种结果表明，AS共轭的APR也能保持良好的特异性同位素介导的内化作用。据悉，当MCF7细胞用EIPA（大针胞抑制剂）预处理时，与用抗生素对照处理的细胞相比，测量到的绿色萤光呈剂量依赖性增长（图2e、g）。但是，用不同浓度的氯丙嗪（一种途径抑制剂）或（一种山洞介导的内吞途径抑制剂）预处理的MCF7细胞的细胞质中观察到显著的Cy3萤光讯号（图2h、i）。这一差别表明，MCF7细胞主要是通过大蛋白胞吞作用摄入的。快速内吞机制可能为改善的细胞膜私密性提供了一种新策略。
图2.a)含血浆培养基中ASCy3和随时间变化的正态化含量；b)HPLC色谱图示意图，显示APR在还原条件和非还原条件下的抗生素释放曲线；c)MCF7细胞和细胞与500nMAS、APR、CRO和CPR培养；e)MCF7细胞经内细胞通路抑制剂（CA，山洞；CL，凝集素；M，大核细胞）预处理并与500nMAPR培养后的共聚焦显微相片；f）物理抑制APR在MCF7细胞中的细胞内化。在对照实验（无抑制剂，（f））的基础上，使用三种内吞途径抑制剂处理后，通过流式细胞仪评估Cy3的相对萤光：EIPA（大胞吞途径)；g)（山洞介导的内吞途径)；h）或（途径）；i)偏差条
为了进一步研究APR的BET降解活性和BET同源物选择性，作者用不同含量的APR和CPR（以PRO为对照）剌激MCF7细胞，进行了印迹剖析（图3a-d)。
APR和PRO都能以含量依赖性方法有效降解BRD4，而在CPR处理的细胞中几乎没有观察到BRD4降解。如图3a和b所示，在50nM的含量下，APR只降解BRD4并达到绝佳的降解效率，而在相同的含量下，几乎没有观察到BRD2和BRD3的降解。当含量降低到100nM时，APR介导的BRD2和BRD3降解率分别为65%和58%。当CPR含量降低到200nM时，在CPR组观察到BRD4有轻微降解。这些结果验证了APR在抒发碱基的MCF7细胞中降解BRD4的效率很高，但是AS修饰对原始PRO的降解活性影响很小。
ASM修饰共轭物对细胞毒性的影响：使用细胞计数试剂盒8（CCK8）测量法评估了APR对MCF7和MCF10A甲状腺癌细胞的抗肺癌活性。在MCF7细胞中（图3e、表S1和图S3，见旁证信息），APR的抗增殖活性（IC50=56.9nM）与PRO（IC50=59.8nM）相当，显著优于CPR（IC50=4.03mM）和AS（IC50=2.60mM）。相比之下，APR对细胞的细胞毒性显著减少（IC50=3.13mM），远高于PRO（IC50=0.67mM），与CPR（IC50=3.54mM）相当（图3f）。
据悉，在测试范围内，AS对据悉，在测试含量范围内，AS对细胞的细胞毒性较弱（IC50=6.90mM）。这种结果表明，在抒发碱基的MCF7细胞中引入AS会造成的选择性细胞毒性。值得注意的是，观察到的选择性可能是因为修饰与PRO固有特点的协同作用。
评估了APR对MCF7细胞自噬的影响（图3g）:用100nMAPR和PRO处理MCF7细胞48小时后，MCF7细胞的自噬率分别为60.1%和60.1%。39.2%。但是，在相同条件下，CPR处理细胞的自噬率降至20.9%，显著高于APR处理细胞的自噬率。对细胞自噬的影响与MCF7细胞增殖活性的增加是一致的。
图3.a)印迹剖析化合物APR和PRO处理24小时后诱导MCF7细胞中BRD2和BRD3降解的疗效；b)相同条件下化合物APR、PRO和CPR对MCF7细胞中BRD4水平的影响；c、d)使用(,US)对印迹结果进行定量剖析；e、f)通过CCK8检查法确定APR、AS、CPR和PRO对靶MCF7细胞和非靶细胞的细胞毒性；g)用不同剂型处理的靶MCF7细胞的自噬情况。
为了测试APR的病变靶点特点:作者使用成像检查法研究了在MCF7异种移植大鼠模型中的组织分布，并以ASCy3和CPRCy3作为对照。通过静脉注射给药后，剖析了ASCy3、和CPRCy3在癌症和主要脏器（心、肝、脾、肺和肾）中的分布情况（图4a）。给药4小时后，处理大鼠肉瘤组织中Cy3的萤光硬度显著低于ASCy3处理大鼠。但是，在CPR处理的大鼠肉瘤组织中几乎没有观察到Cy3萤光。据悉，所有三种化合物都主要分布在胰腺和肝脏。给药8小时后，APRCy3处理大鼠肉瘤组织中的Cy3萤光硬度仍低于ASCy3处理大鼠，而处理小鼠病变组织中未观察到Cy3萤光。据悉，三组大鼠的肾脏、脾脏或脑部在两个时间点均未测量到萤光讯号。为了进一步验证ASPRO共轭物在MCF7异种移植物中是否具有肝病靶点能力，作者对在大鼠体内的分布进行了加成测试，并评估了其在体内的集聚情况（图4b）。与在之前的实验中，ASCy3和被选为对照组。有趣的是，能否辨识MCF7病变细胞并集聚在癌症中，由于萤光在病变组织中的保留时间远远长于对照组中和ASCy3的保留时间。据悉，注射8小时后，癌症中仍可观察到强烈的萤光讯号，而处理过的大鼠肉瘤中则未观察到萤光讯号。这种结果表明，APR在MCF7异种移植模型中表现出卓越的癌症靶点能力。
作者在MCF7异种移植大鼠模型中评估了APR的体内抗肺癌效果。当癌症植入后平均容积达到150立方毫米时，家兔被随机分为六组。PBS或AS、CRO、PRO、CPR或DNA剂量为10mM的APR（PRO的剂量为10mgkg-1）隔日静脉注射一次。如图4c和d所示，PRO能有效抑制肿瘤生长，医治21天后病变生长抑制率（TGI）达到59.8%。相比之下，CRO在体内没有表现出抗肺癌活性。有趣的是，APR在体内表现出了卓越的抗肺癌功效，其TGI率为77.5%，这表明APR的效力显著低于CPR（TGI=20.2%）和AS（TGI=28.8%）
据悉，还进一步评估了APR在异种移植大鼠模型中的毒性。在医治期间，每3天检测一次诊治大鼠的体重（图4e）。所有化合物在医治组中的耐受性都挺好，体重没有显著增长，也没有显著的不良反应。接着，称量了受试大鼠的主要脏器重量，以评估毒性（图4f）。不同组间各脏器的重量无显著差别。
与对照化合物相比，APR在诱导细胞自噬方面表现更好（图4g）。APR组中Ki67染色细胞的数目显著高于其他组，这意味着APR的TGI效果最好。为了进一步阐述体内BRD4的降解效率，使用抗BRD4抗原进行了免疫组化。如图4h所示，与空白对照组相比，化合物CRO和AS只造成BRD4抒发发生轻微变化，而PRO和APR处理组的BRD4抒发则明显升高。值得注意的是，APR比PRO更有效地减少了BRD4的抒发细胞膜选择性通透，这表明AS修饰提高了大鼠体内BRD4的降解。
图4.a、b)静脉注射后ASCy3、和在主要脏器（H，肾脏；Li，肾脏；S细胞膜选择性通透，卵巢；L，肾脏；K，心脏）和癌症（T）中的体内分布；c)以每隔三天给药一次的频度进行静脉注射医治的21天期间癌症容积的变化。红色箭头表示给药时间点；d)不同组的异种移植肉瘤在接受所示医治21天后的宏观观察结果。红色箭头表示给药时间点；f)使用所示不同剂型进行静脉注射医治21天期间的癌症和脏器重量剖析，给药频度为每隔三天一次；g)六个医治组Ki67染色的病变组织切块显微相片；h)六个医治组BRD4染色的病变组织切块显微相片（尺度条，200毫米)。
小结与讨论
此项研究开发了一种用适配体修饰的新策略，以克服传统的局限性。作者首次证明，联接有助于提升癌症靶点的特异性，因而提高体内抗肺癌活性和蛋白降解，增加毒性。因而，这项工作中构建的创新型APC技术具有改善传统抗生素亲和性的潜力。重要的是，因为适配体在精准医疗方面的优势，这些适配体修饰策略可能会在靶点蛋白质降解方面有广泛的应用。
作者今后的工作将旨在于探求多种适配体和设计新型联接体，以提升癌症组织的特异性和临床效果。
原文链接
B1B1
撰稿|张嘉怡
排版|郝红依
初审|陈正虎老师