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人红细胞膜示意图(包括了主要蛋白质的分子结构)
垂直作用为垂直于膜平面，以锚定蛋白和联接蛋白复合物为代表，联接膜血影蛋白骨架和嵌入脂类双分子层的整个蛋白。水平互相作用为平行于膜平面，由血影蛋白四聚体和蛋白4.1R参与。b3：带3蛋白；GPA/GPC：血型糖蛋白A/C；GLUT-1：蓝莓糖转运蛋白-1；：锚定蛋白；p55：鸟苷酸激酶(MAGUK)蛋白家族磷蛋白。(9th,2016.)
红细胞膜结构与自身抗原的“分子时钟”机制
红细胞膜在红细胞的功能和结构中起关键作用。它具有奇特的双凹圆盘形状，确保红细胞具有良好的稳定性及变型能力，使红细胞还能承受循环剪切压力，当通过窄小的脾窦及微血管时才能承受反复的扭曲，保证120天的寿命。红细胞膜表面保持非活化状态，因此不粘附于内皮细胞或互相积聚而阻塞微循环。它具有选择性通透屏障，保留细胞内的必要成份，并容许代谢产物排出。为了推动气体的转移和维持pH平衡，细胞膜进行氯离子和碳酸氢根阴离子交换，并控制阳离子和水的浓度。膜的隔离作用增加了外界对血红蛋白及其他细胞成份的氧化伤害，而且通过可逆性地结合和选择性地灭活糖酵解酶调节细胞代谢。(9th,2016.)
红细胞膜是一个复杂的结构，包含一个相对流动的脂类双分子层，由底层二维膜骨架稳定，维持了红细胞双凹圆盘状的形态。骨架提供了细胞快速反复变型的硬度和柔硬度，这样才能承受微循环毛细血管及肾脏中遇见的剪切挠度。脂类双分子层包含磷脂和固醇以及必需的跨膜蛋白，通过与联接蛋白的互相作用而固定在膜骨架上，将红细胞胞浆与血清隔离开。无核红细胞在人类细胞中是独一无二的，由于其惟一的结构成分质膜决定了其各类抗体、运输和机械特点。红细胞的盘状形状是由网织红细胞在48小时的成熟过程中首先在骨髓之后在循环中演化而至的。盘状人类红细胞的一个重要且明显的特点是，在其120天的生命周期中，它还能在反复穿过微循环窄小的毛细血管(横截面为其自身半径的三分之一)时经历较大的被动变型。这些特点最显著的表现是在体内红细胞从脾索转移到脾窦的过程中以及体外流动造成的变型过程中(如右图)。个别癌症的异常红细胞可因为变型性增加进而被脾隔离，致使红细胞寿命减短及溶血性肾炎。(N,etal.Blood,2008.)
(左上)网织红细胞；(右上)成熟盘状红细胞前体；(左下)穿过脾索到脾窦的红细胞，注意红细胞在通过分隔脾索和窦的窄小内皮狭缝时所经历的显著变型；(右右图)盘状红细胞体外流动诱导变型形成的椭圆形细胞。
红细胞脂类双分子层约构成红细胞膜重量的50%，包含几乎等量的未水解固醇和磷脂以及少量糖脂和磷脂酰肌醇。红细胞上的糖脂仅存在于膜的外侧面，带有伸向胞浆的碳水化合物，携带包括ABH、P等在内的数个重要红细胞抗体。而内在或跨膜蛋白通过疏水互相作用嵌入在脂类双分子层中，它们常常从双分子层凸出延展到血清和/或红细胞内部，这种结构特点与它们运输蛋白、受体、信号分子和携带红细胞抗体功能有关。大部份跨膜蛋白也定义了各类血型抗体，并表现出多种功能异质性，充当转运蛋白、参与红细胞与其他血细胞和内皮细胞互相作用的黏附蛋白、信号传导受体以及其他仍未定义或发觉的活性等。(TJ,etal.,2021;9th,2016.)
毫无疑惑的，人红细胞在其经历的生存周期中会逐步迈向衰老并被消除。正常红细胞寿命约120天，红细胞的生命迈向终结最常见的形式是被巨噬细胞吞噬。巨噬细胞吞噬是一种高效的清理方法，每秒可吞噬约500万个红细胞，并不会造成循环中的血红蛋白显著下降。其实，必将存在一些讯号，使巨噬细胞可将年青的成熟红细胞与受损的或则老化的红细胞区分开来，这种讯号可能包括细胞变型性的增长和(或)膜表面特点的改变等。衰老的红细胞被破坏可能存在几种不同机制，因为标记的正式破坏的细胞最后会被消除，在外周血中浓度很低或没有，因而确定红细胞真正破坏机制非常困难。许多初期的资料是通过研究密度较高的细胞所得，这群细胞被觉得是“老化的”，而目前觉得并非这么。网织红细胞在成熟过程中线粒体和内质网体逐渐消失，细胞密度骤然降低，而且红细胞成熟后步入血管几天后，红细胞密度不再进一步降低，其他数学特点也不再改变，所以红细胞密度不能作为红细胞衰老的标志，这促使标志红细胞将被破坏的衰老改变的研究十分困难。以前，有很大部份研究觉得红细胞膜带3蛋白的改变及膜磷脂酰甘氨酸的曝露作为红细胞衰老改变的候选标志物，可能具有重要意义。(LutzHU,etal.Front,2013;9th,2016.)
这涉及到对红细胞衰老机制的研究提出的一个重要假定，主要是由Kay在20世纪80年代早期完成的，即人类红细胞衰老是因为天然存在的自身抗原引起衰老红细胞膜上带3成份的变化。(KayMM.,1985.)
而为了验证这个假定，2021年10月日本艾伯塔学院E等人借助共聚焦显微镜和蛋白质物理方式测量了红细胞膜带3蛋白的一个具有未知性的拓扑结构(带3蛋白多肽的812-830区域)的构型改变，此类动力学改变提供了一种可能的“分子时钟”机制，因而解释了IgG自身抗原在衰老红细胞上的集聚，并最终造成了巨噬细胞对老化红细胞的吞噬和清理的机制(右图)。(KE,etal.Acta,2021.)
红细胞“分子时钟”模型
如上诸图所示，带3蛋白(白色，显示为二聚体)是一个双结构域蛋白，由一个完整的膜结构域(M)和一个由灵活的联接体联接到细胞质内的结构域(C)组成。带3蛋白的812-830区域(柠檬色椭圆形)主要是坐落细胞质中的(State1)，但可以暂时性重新定位到细胞外环境(State2)。这些短暂的重新定位将812-830抗体决定簇区域放在了胞外具有免疫反应性的538-554区域(蓝红色椭圆形)后面。这些先前未知其明晰作用的812-830区域细胞外的官能团可以在胞外与循环中细胞衰老相关的人自身抗原(IgG，白色Y形)互相作用，造成带3蛋白作为特异性抗体被自身抗原不可逆地捕获，当自身抗原簇在红细胞表面集聚达到一定程度的密度阀值时(“分子时钟”机制的精准调养下，达到阀值时刻即为该红细胞生命期的终点)，巨噬细胞开始辨识该红细胞并启动吞噬作用机制。而如胞外的812-830抗体决定簇区域不被自身抗原捕获，则812-830区域仍可重新回复到其原有的细胞内定位。这些机制，为其形象地命名为“分子时钟”机制。
带3蛋白膜结构域X射线晶体结构
(分子时钟主要机制)
带3交替构型的模型。显示了在晶体结构中的带3膜结构域(，左)，及与812-830区域(，右)的细胞外可及性建模交替构型。分别从脂类双分子层(下层)和细胞外环境(上层)的平面视角观察带3蛋白。红色显示膜脂，并突出显示了两个红细胞衰老相关抗体表位:残基812-830(柠檬色)和538-553(蓝红色，胞外残基554为白色)。(KE,etal.Acta,2021)
至此，长久以来对人红细胞相关自身抗原的机制、作用意义及对应的特异性靶抗体的猜想和探求，终尘埃落地，有了一个较为明确的理论和经过实验严格验证的精准的靶向。
"剥开迷雾，找寻真相”
——曾经走过的路
01温自免溶贫与自身抗原
温自身免疫性溶血性肾炎(wAIHA)是一种自身免疫性血液癌症，病人会形成针对自身红细胞的自身抗原。wAIHA可能是特发性的，没有任何早已完全明晰的机制，或则是继发于个别癌症如慢性淋巴细胞肺癌，或服药如α-甲基多巴等。近来，wAIHA被报导与检测点抑制剂疗法的使用相关如用于医治个别恶性脑瘤的抗PD-1。wAIHA的特征是获得性溶血性胃炎，有时会殃及生命。IgG、补体(C3d/g)或二者的直接抗人球蛋白试验(DAT)常常呈阴性。病人红细胞的放散液和血浆富含针对几乎所有红细胞的抗原，没有显著的特异性。从历史上看，这种自身抗原可与Rh血型系统有关，由于它们一般不与缺少Rh抗体的罕见红细胞发生反应；不过，也有关于针对特定红细胞抗体(如D、Jka、E、Ge、Wr等)的特异性或模拟抗原()的孤立报导，它们虽然又可以类似于同种抗原。(PetzLD,etal.,2004;DoleyGEPB,etal.EurJ,2019.)
另外，在初期使用密度梯度离心进行红细胞年纪分级，也发觉温自身抗原可以按照其与含有网织红细胞或缺少网织红细胞的不同红细胞组的反应性进行分类。许多温自身抗原与含有网织红细胞的红细胞组反应不太强烈或根本不反应。这一发觉也促使提出了这种温自身抗原的血型特异性的问题。(DR,etal.Blood,1984.)
从历史上看，自身抗原曾被觉得具有多种靶向特异性。初期的许多研究确定，许多这种自身抗原未能与缺少Rh血型抗体的稀有红细胞发生反应，如等。为此，温自身抗原最初被觉得与Rh抗体发生反应。但是，多年来关于温自身抗原额外特异性的其他报导开始出现，包括Jka、Kell、、、血型糖蛋白A以及D和LW抗体。为了更好地了解温自身抗原的特异性过去曾进行了大量的研究，随着越来越多的显著证据出现，突显了红细胞上的带3蛋白与自身抗原特异性密切相关，而且很可能是这种自身抗原的主要目标靶抗体。值得注意的是，血型糖蛋白A和Rh血型抗体等均与带3蛋白相关细胞膜选择性通透，抗体也坐落带3蛋白上。已知红细胞中Rh抗体的遗失会对红细胞膜的氢键形成影响，造成相关的肝炎。为此，之前使用红细胞对自身抗原不反应进而推论个别温自身抗原具有Rh特异性的报导可能正是因为带3蛋白的改变，由于温自身抗原辨识的正是带3的表位，而当带3表位构型变化时，自身抗原则无法辨识了，但前述给人的印象似乎是自身抗原是指向Rh而不是带3。(BlochEM,etal.,2020;DR.CurrOpin,2023.)
02带3蛋白与温自身抗原
带3蛋白(Band3，AE1/)是一种跨膜阴离子交换蛋白。它的作用是交换氯化氢盐和硝酸物，是抒发量最高的红细胞膜蛋白，它在结构和生理两方面都起作用。(MJ.MolMembrBiol,1997.)
带3蛋白相关结构机制及与血型的相关性，请参见本公众号前期发表的原创文章，链接如下：、
带3蛋白通过其与锚定蛋白和细胞骨架网路的数学联接为红细胞提供机械支持。带3与多种蛋白(包括Rh)以及两种特定复合物的互相作用有助于细胞形态、组织的保护和维持红细胞的完整性。带3的蛋白-蛋白互相作用的任何变化，都可能影响带3出现个别不同构象状态的变化，这其中也指向性的启示了人们对温自身抗原辨识的红细胞自身抗体特异性的探察。(KayMM.,1985.)
据悉，带3蛋白也被觉得是一种可以曝露新抗体的蛋白质，历史上，该新抗体以前成为了特定意义的衰老红细胞抗体，因而诸多假定也提出了带3蛋白与红细胞衰老密切相关。
在20世纪80年代，曾有两项互相独立不同的研究均报告了温自身抗原与红细胞年纪相关。两组均报告称，wAIHA病人的温自身抗原活性中很大一部份优先与较陈旧的红细胞发生反应。发觉与成熟红细胞相比，从wAIHA病人红细胞中放散出来的自身抗原中有4/5(80%)左右对含有网织红细胞的反应较弱。她们曾将这些差别反应性归结于Rh系统，由于曾发觉网织红细胞与抗-D的反应性高于成熟红细胞。后来的研究中，在使用密度梯度来有效分离网织红细胞与成熟红细胞后，对24名wAIHA病人进行DAT时发觉，79%的病人网织红细胞上的IgG比其成熟、较老的红细胞上的IgG少得多。37%的病人中，网织红细胞富集部份的DAT呈阳性。研究还发觉，这些反应差别性并非由Rh造成，由于使用正常健康人血液对其网织红细胞和老年陈旧红细胞上测量了多种不同的抗Rh系统抗原，发觉反应性没有差别。近日，有研究使用不连续梯度分离22名wAIHA病人的含有网织红细胞和老年红细胞，否认了温自身抗原的这些特异性。另有研究通过蛋白质印迹和使用LC-MS(气相色谱质谱联用仪)的结果表明，温自身抗原是与红细胞上的带3蛋白发生反应。这种结果也说明了，大多数wAIHA病人体内的自身抗原可能代表着正常红细胞衰老的激化。(GrayLS,etal.BrJ,1983;DR,etal.Blood,1984;DR.CurrOpin,2023.)
毫无疑惑地，也正是对红细胞衰老进程的研究，逐渐解开了人类红细胞自身抗原特异性靶向之谜，对自身抗原作用意义、机制的探求也是探索人类红细胞衰老及清理机制的过程。
03带3蛋白与衰老红细胞抗体
由Kay在20世纪80年代早期完成的红细胞衰老机制的研究提供了第一个假定，即人类红细胞衰老是因为天然存在的自身抗原引起衰老红细胞上带3膜成份的变化。结果表明，自身抗原结合是因为红细胞的氧化应激所致，假定觉得衰老红细胞抗体的分子大小在55-65kDa之间，由带3蛋白的两部份组成。在带3的第3个外环上发觉一种肽(肽1，多肽538–554)和第二种肽(肽2，多肽812–830)，它可以步入细胞内和细胞外环境，但是当在细胞外表达时，形成被自身抗原辨识的新抗体。据悉，红细胞老化和氧化可能通过影响肽2的定位来推动这些新抗体的产生。肽1和肽2对于红细胞衰老抗体构型的产生都是必需的，这一观点最初即来自前述Kay的研究工作。(KayMM..1985.)
时隔多年以后，在2021年等借助共聚焦显微镜和蛋白质物理方式研究表明肽2在其内部与外部定位中是动态的，而且它在红细胞膜上的内部和外部位置之间振荡，即“分子时钟”理论(本文章引文部份)。她们假定，当两种肽都可以从外部接触时，针对该构型抗体的天然自身抗原还会结合，但是因为肽2处于短暂的细胞外部状态，自身抗原将结合并“保持”该抗体构型，直至积累足够的自身抗原，再通过激活巨噬细胞上的Fc受体来启动对衰老红细胞的吞噬清理。(KE,etal.Acta.2021)
总结前述众多研究和理论细胞膜选择性通透，目前早已能确定，红细胞上的带3蛋白是wAIHA病人自身抗原的红细胞特异性靶向抗体。在大概80%的病例中，wAIHA靶点破坏的是较老的红细胞，研究也表明这种病人的红细胞比正常人红细胞衰老得更快。在这80%的病人中，自身抗原辨识带3蛋白上的衰老红细胞抗体。进一步假定这些自身抗原的形成和效力因红细胞衰老抗体的免疫而减缓，红细胞衰老抗体通过适应性免疫系统加工形成致病性自身抗原。近来的研究推论也支持了原本的假定，即衰老的红细胞抗体是通过一个动态过程曝露的，其中带3蛋白二环翻转到细胞表面因而形成了一个新构型的抗体，即衰老红细胞抗体，也即自身抗原的红细胞特异性靶抗体。
主编：钟靖
我不再将这个世界与我所期盼的，
打造的完满世界比照，
而是接受这个世界，
爱他，属于他。
——赫尔曼·黑塞《悉达多》