显微镜的种类及其使用方式
一、光学显微镜
光学显微镜是一种精密的光学仪器。当前使用的显微镜由一套透镜配合，因此可选择不同的放大倍数对物体的细微结构进行放大观察。普通光学显微镜一般能将物体放大1500～2000倍(最大的区分力为0.2μm)。
（一）光学显微镜的基本结构（附图1）
1．光学部发包括物镜、物镜、聚光器和光源等。
（1）物镜一般由两组透镜组成，下端的一组又称为“接物镜”，上端的则称为“场镜”。二者之间或在场镜的下方装有视场光阑（金属环状装置），经目镜放大后的中间像就落在视场光阑平面上，所以其上可加置物镜测微尺。在物镜上方刻有放大倍数，如10×、20×等。根据视场的大小，物镜可分为普通物镜和广角物镜。有些显微镜的物镜上还附有视度调节机构，操作者可以对左右眼分别进行视度调整。另有拍照物镜(NFK)可用于拍摄。
（2）目镜由链表透镜组成，安装于转换器上，又称接目镜。一般每台显微镜配备一套不同倍数的目镜，包括：①低倍目镜：指1×～6×；
②中倍目镜：指6×～25×；
③高倍目镜：指25×～63×；④油浸目镜：指90×～100×。
其中油浸目镜使用时需在目镜的下表面和盖玻片的上表面之间填充折射率为
1.5左右的液体（如香柏油等），它能明显地增强显微观察的帧率。其他目镜则直接使用。观察过程中目镜的选择通常遵守由低到高的次序，由于低倍镜的视野大，以便查找待检的具体部位。显微镜的放大倍数，可简略视为物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。
（3）聚光器由聚光透镜和虹彩焦段组成，坐落在载物台下方。聚光透镜的功能是将光线聚焦于视场范围内；透镜组下方的虹彩焦段可开大缩小，以控制聚光器的通光范围，调节光的硬度，影响成像的区分力和反差。使用时应按照观察目的，配合光源硬度加以调节，得到最佳成像疗效。
（4）光源较早的普通光学显微镜利用镜座上的反光镜，将自然光或灯光反射到聚光器透镜的中央作为镜检光源。反光镜是由一平面和另一凹面的穿衣镜组成。不用聚光器或光线较强时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用；用聚光器或光较弱时，通常都用平面镜。新近出产的显微镜通常直接在镜座上安装光源，并有电压调节螺旋，用于调节光照硬度。光源类型有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。
显微镜的光源照明方式分为两种：透射型与反射(落射)型。后者是指光源由下而上通过透明的镜检对象；反射型显微镜则是以目镜上方打光到(落射照明)不透明的物体上。
2.机械部发包括镜座、镜柱、镜壁、镜筒、物镜转换器、载物台和准焦螺旋等。
（1）镜座底座部份，用于支持整台显微镜的平稳。
（2）镜柱镜座与镜臂之间的直立角柱，起联接和支持的作用。
（3）镜臂显微镜后方的弓形部份，是联通显微镜时抓握的部位。有的显微镜在镜臂与镜柱之间有一活动的倾斜关节，可调节物镜向后倾斜的角度，以便观察。
（4）物镜安装在镜臂先端的圆筒状结构，上连物镜，下联接目镜转换器。显微镜的国际标准筒长为160mm，此数字标在目镜的壳体上。
（5）目镜转换器物镜上端的可自由旋转的圆盘，用于安装目镜。观察时通过转动转换器来调换不同倍数的目镜。
（6）载物台物镜下方的平台，中央有一方形的通光孔。用于放置载玻片。载物台上装有固定标本的弹簧夹，两侧有推动器，可联通标本的位置。有些推进器上还附有刻度，可直接估算标本联通的距离以及确定标本的位置。
（7）准焦螺旋装在镜臂或镜柱上的大小两种螺旋如何使用平面镜进行立体成像，转动时可使物镜或载物台上下联通，进而调节成像系统的焦距。大的称为粗准焦螺旋，每转动一圈，物镜升降10mm；小的为细准焦螺旋，转动一圈可使赤道仪仅升降0.1mm。通常在低倍镜下观察物体时，以粗准焦螺旋迅速调节物像，使之坐落视野中。在此基础上，或在使用高倍镜时，用细准焦螺旋微调。必须注
意，通常显微镜装有左右两套准焦螺旋，作用相同，但切忌双手同时转动一侧的螺旋，避免因右手力量不均形成力矩，致使螺旋滑丝。
（二）普通光学显微镜的基本成像原理
光线→（反光镜）→遮光器→通光孔→镜检样品（透明）→物镜的透镜（第一次放大成倒立虚像）→镜筒→目镜（再度放大成实像）→眼。
（三）普通光学显微镜的使用过程
1．镜检前的打算室外应清洁而干燥，实验台台面水平，稳固无振动，显微镜附近不应放置腐蚀性的试剂。从显微镜柜或镜箱内取出显微镜时，要用双手握住镜臂，右手托住镜座，平稳地取出，放置在实验台桌面上，放在操作者左前方，距实验台边沿约10cm，镜臂朝自己，物镜朝前。实验台左侧放绘图用品。
2．调节光源如需借助内置光源，宜采用散射的自然光或轻柔的灯光。直射的太阳光会对观察者的耳朵导致伤害。转动转换器，使低倍镜正对通光孔，将聚光器上的虹彩焦段开到最大，观察物镜中视野色温，同时调节反光镜角度，使光照达到最明亮最均匀。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照的强弱。
3．装置待检玻片将待观察的样品制做成临时或永久装片，置于载物台上，用弹簧夹固定，有盖玻片的一面朝上。联通推动器，调节待检样品至通光孔的中心。
4．低倍镜观察将低倍镜对准通光孔，缓缓转动粗准焦螺旋，将目镜与装片的距离调至近来。注意不要压碎盖玻片。通过物镜观察，同时用粗准焦螺旋平缓调节，直到物像出现，再用细准焦螺旋微调，同时调节光源色温与虹彩焦段的大小，使物像达到最清晰的程度。并借助推动器把须要进一步放大观察的部份移至视野中央。假如使用双筒物镜，应在观察前先调整双筒距离，使双眼视场合并。
5．高倍镜观察转动转换器，选择较高倍数的目镜，用细准焦螺旋调节焦距，到物像清晰为止。
6．油镜观察油浸目镜的工作距离（指目镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，通常在0.2mm以内，且通常光学显微镜的油浸目镜没有“弹簧装置”，因而使用油浸目镜时，变焦速率必须放慢，防止压碎玻片，并使目镜损坏。
（1）在低倍镜下找到观察目标，中、高倍镜下逐渐放大，将待观察部位放在视野中央，调节光源和虹彩焦段，使通过聚光器的亮光达到最大。
（2）转动粗准焦螺旋，将物镜上旋（或将载物台增长）约2cm，加一小滴香柏油于玻片的镜检部位上。
（3）将粗准焦螺旋缓缓转到，同时注意从侧面观察，直到油镜溶入油滴，镜头几乎与标本接触。
（4）从物镜中观察，用细准焦螺旋微调，直到物象清晰。
（5）镜检结束后，将镜头旋离玻片，立刻清洁镜头。通常先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油滴。再用擦镜纸蘸少许乙腈酒精混和液（2：3），擦去残留锈斑，最后再用干净的擦镜纸擦净（注意向一个方向擦洗）。
7．还原显微镜关掉外置光源并拔下电源插座，或使反光镜与聚光器垂直。旋转目镜转换器，使物镜头呈命理形位置与通光孔相对。再将物镜与载物台距离调至近来，降下聚光器。罩上防尘罩，将显微镜放回柜内或镜箱中。
二、几种特殊的光学显微镜
（一）暗视野显微镜
暗视野显微镜不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以区分
0.004μm以上的微粒的存在和运动。因此常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。当一束光线透过黑暗的卧室，从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条亮光的尘土“通路”，这些现象即丁达尔效应。暗视野显微镜在普通的光学显微镜上换装暗视野聚光镜后，因为该聚光器内部抛物面结构的遮挡，照射在待检物体表面的光线不能直接步入目镜和物镜，仅散射光能通过，因此视野是黑暗的。操作者通过物镜观察到的，是检物体的衍射光图象（附图12）。
暗视野显微镜的基本使用方式如下：
1．安装暗视野聚光器（或用柔软的黑纸片制成遮光板，置于普通显微镜的聚光器下方，也能得到暗视野疗效）。
2．选用强光源，通常用显微镜灯照明，以避免直射光线步入目镜。
3．在聚光器和玻片之间加一滴香柏油，防止照明光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。
4．进行中心调节，即水平联通聚光器，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格坐落仍然线上。升降聚光器，将聚光镜的焦点（图2中圆柱光束的顶点）对准待检物。
5．选用与聚光器相应的目镜，调节焦距，按普通显微镜的方式操作。
（二）体视显微镜
体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，其成像为正立三维的空间影像，并具有立体感强、成像清晰宽广、长工作距离（一般为110mm）以及连续放大观看等特性。生物学上常用于解剖过程中的实时观察（附图13）。
普通光学显微镜的光源为平行光，因此产生的是二维平面影像；而体视显微镜采用双通道光路，双目物镜中的左右两光束具有一定的倾角体视角（通常为），因此能产生三维
空间的立体图象。体视显微镜与普通光学显微镜的使用方式相仿，但更为方便。两者的主要区别在于：
1.体视显微镜的镜检对象可毋须制做成装片。
2.体视显微镜载物台直接固定在镜座上，并配有黑白双面板或玻璃板，操作者可依照镜检的对象和要求加以选择。
3.体视显微镜的成像是正立的，以便解剖操作。
4.体视显微镜的目镜仅一只，其放大倍数可通过旋转调节螺旋连续调节。
（三）萤光显微镜
萤光显微镜是借助细胞内物质发射的萤光硬度对其进行定性和定量研究的一种光学工具。细胞内的萤光物质物质有两类，一类直接经紫外线照射后即可发萤光，如叶绿素等；另有一些物质本身不具这一性质，但若果以特定的萤光颜料或萤光抗原染色，经紫外线照射后亦可发萤光（附图1-4）。
萤光显微镜的原理为借助一个易发光效率的点光源（如超高压汞灯），经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650λ或紫蓝光4200λ)作为迸发光，迸发标本内的萤光物质发射出各式的萤光后，再通过目镜旁边的阻断(或压制)滤光片的过滤，最后经由物镜的放大作用加以观察。阻断滤光片的作用有二：一是吸收和抵挡迸发光步入物镜以免干扰萤光和损伤鼻子；二是选择并让特定的萤光透过，表现出专情的萤光色调。
萤光显微镜根据光路原理可分为两种：
1．透射式萤光显微镜较为新式的萤光显微镜，其迸发光源通过聚光镜穿过标本材料来迸发萤光。其优点是低倍镜时萤光强，而缺点是随放大倍数降低其萤光减小。所以它仅适用于观察较大的标本材料。
2．落射式萤光显微镜迸发光从目镜向下落射到标本表面，即用同一目镜作为照明聚光器和搜集萤光的目镜(附图1-5)。
光路中需加上一个双色束分离器（分色镜），它与光轴呈45o角，迸发光被反射到目镜中，并集聚在样品上，样品所形成的萤光以及由目镜透镜表面、盖玻片表面反射的迸发光同时步入目镜，返回到双色束分离器，使迸发光和萤光分开，残余迸发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的迸发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同萤光反应产物的须要。此种萤光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大萤光愈强。
（四）相差显微镜
相差显微镜是能将光通过物体时形成的相位差（或光程差）转变为振幅（光硬度）变化的显微镜。主要用于观察活细胞、不染色的组织切块或缺乏反差的染色标本。人眼只能分辨可见光的波长（颜色）和振幅的变化，不能分辨相位的变化。而大多数生物标本高度透明，光波通过后振幅基本不变，仅存在相位的变化。相差显微镜基本把透过标本的可见光的光程差弄成振幅差，因而提升了各类结构间的对比度，使各类结构显得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原先的光路，同时被延后了1/4λ（波长），倘若再降低或降低1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉强化，振幅减小或减下，提升反差（见图6）。
从结构上看，相差显微镜与普通光学显微镜不同之处在于：
1．环型光阑具有环型开孔的光阑，安装在光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线产生空心光锥，聚焦到标本上。
2．相位板相差显微镜在目镜内部降低了涂有氯化镁的相位板，作用是将直射光或衍射光的相位延后1/4λ。相板上有两个区域，直射光通过的部份叫“共轭面”，衍射光通过的部份叫“补偿面”。相位板按工作疗效分为两种类型：
（1）A+相板：将直射光延后1/4λ，两组光波合轴后光波叠加，振幅加强，标本结构比周围介质愈发明亮，产生亮反差（或称负反差）。
（2）B+相板：将衍射光延后1/4λ，两组光线合轴后光波相乘，振幅变小，标本结构比周围介质愈发灰暗，产生暗反差（或称正反差）。带有相板的目镜叫相差目镜，常在目镜壳体上标以“Ph”字样。
3．合轴调节望远镜
相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在壳体上标有“CT”符号），用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合，便于实现对直射光和衍射光的特殊处理。使用时拨去两侧物镜，插入合轴调节望远镜如何使用平面镜进行立体成像，调节合轴调节望远镜的焦点，视野中会呈现两个圆环，分别是明亮的环状光阑圆环与较暗的相板上共轭面圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节螺旋，使两环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。假如聚光器已升到最低点或降到最高点而仍不能矫治，说明玻片太厚了，应更换。调好后即可取下合轴调节望远镜，换回物镜。
4．红色滤光片
用于调整光源的波长。照明光线的波长不同，会导致相位的变化，为了获得良好的相差疗效，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，一般是用红色滤光片来调整。相差显微镜的使用步骤如下：
①根据待检标本的性质及要求，选购适宜的相差目镜。
②将标本玻片放在载物台上，进行光轴中心的调整。
③使用合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合后，换回物镜。在观察过程中，每次更换目镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。
④加红色滤光片，按普通光学显微镜的操作步骤进行观察。
（五）倒置显微镜
倒置显微镜的结构和普通显微镜基本相同，只不过目镜与照明系统位置交换，后者在载物台之下，前者在载物台之上。主要用于观察培养的活细胞，需配制相差目镜。
（六）偏光显微镜
偏光显微镜可用于测量具有双折射性的物质，如染色体、胶原、纤维丝等（附图1-7）
和普通显微镜不同的是：
①偏光显微镜光源前配备偏振光镜（起偏器），使步入显微镜的光线为偏振。
②镜筒中有检偏振光镜（检偏器，一个偏振光方向与起偏器垂直的的起偏器）。
③使用旋转载物台。当载物台上倒入单折射的物质时，无论怎样旋转载物台，因为两个偏振光片是垂直的，显微镜里看不到光线，而倒入双折射性物质时，因为光线通过这类物质时发生偏转，因而旋转载物台便能测量到这些物体。
④配备补偿器或相位片；
⑤使用专用无挠度目镜。
三、电子显微镜
电子显微镜是借助高速运动的电子束来取代光波的一种显微镜。光学显微镜下只能清楚地观察小于0.2μm的结构。而大于0.2μm的结构称为亚显微结构（）或超微结构（；）。要想认清这种更为细微的结构，就必须选择波长更短的光源，以提升显微镜的帧率。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，但是电子束的波长与发射电子束的电流平方根成正比，也就是说电流越高波长越短。因而电子显微镜的码率远低于光学显微镜，目前可达0.2nm，放大倍数可达80万倍。电子显微镜的基本要结构包括赤道仪、真空系统和电源柜三部份。物镜主要由电子枪、电子透镜、样品架、荧光屏和拍照机构等部件，自上而下地装配成一个柱体；真空系统包括机械真空泵、扩散泵和真空球阀三部份，并通过抽喉管道与物镜相连接；电源柜由高压发生器、励磁电压稳流器和各类调节控制单元组成。电子透镜是电子显微镜物镜中的关键部件。现代电子显微镜大多采用电磁透镜，由稳定的直流电枢电压通过带极靴的线圈形成的强磁场使电子聚焦。电子枪的作用是发射并产生速率均匀的电子束，由钨丝（阴极）、栅极和阳极（加速极）构成。阴极管发射的电子通过基极上的小孔产生射线束，经阳极电流加速后射向聚光镜，起到对电子束加速、加压的作用。使用中加速电流的稳定度要求不高于万分之一。电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。其中生物学研究中使用最为广泛的是透射式和扫描式电子显微镜。后者常用于观察这些用普通显微镜所不能辨认的细微物质结构；前者主要用于观察固体表面的形貌。
（一）透射式电子显微镜
透射电子显微镜（，TEM）的组件包括：
1.电子枪发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。
2.聚光透镜即电子透镜，将电子束集聚，可用于控制照明硬度和孔径角。
3.样品室放置待观察的样品，并装有旋转台，用以改变试样的角度，还有装配加热、冷却等设备。
4.目镜为放大率很高的短距透镜，作用是放大电子像。目镜是决定透射电子显微镜鉴别能力和成像质量的关键。
5.中间镜为可变倍的弱透镜，作用是对电子像进行二次放大。通过调节中间镜的电压，可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。
6.透射镜为高倍的强透镜，用将二次放大后的中间像进一步放大后在萤光屏上成像。
7.二级真空泵对样品室抽真空。
8．拍照装置用以记录影像。因为电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等就会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的纤薄切块，一般为50～100nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品须要处理得很薄。一般用薄切块法或冷藏刻蚀法制备：
（1）薄切块法一般以锇酸和戊二醛固定样品，以醇酸树脂包埋，以热膨胀或螺旋推动的方法加快样品切块，切块长度20～50nm，采用重金属盐染色，以减小反差。
（2）冷藏刻蚀法称作冰冻破裂法。将标本放在100?C的干冰或196?C的液氮中冰冻后，以冷刀飞速断掉标本。破裂的标本升温后，冰在真空条件下迅即升华，曝露出断面结构，称为刻蚀。刻蚀完成后，向断面以45o角涂装一层蒸汽铂，再以90o角涂装一层碳，强化反差和硬度。之后用双氧水碱液消化样品，剥下碳和铂的膜，称为复膜，能显示标本刻蚀面的形态。在电镜下观察得到的影像即代表标本中细胞破裂面处的结构。
（二）扫描式电子显微镜
扫描电子显微镜（，SEM）于20世纪60年代问世，目前区分力可达6～10nm。其工作原理是由电子枪发射的精细聚焦电子束经两级聚光镜、偏转线圈和目镜射到样品上，扫描样品表面并迸发出次级电子，次级电子的形成量与电子束入射角有关，即与样品的表面结构有关。次级电子经侦测体搜集后，由闪动器转换为光讯号，再经光电倍增管和放大器转变为联通号来控制萤光屏上电子束的硬度，显示出与电子束同步的扫描图象。图象为立体形象，反映了标本的表面结构。扫描电镜的标本在检验前，需进行固定、脱水处理，再涂装上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子讯号。