实验材料
胶原酶
试剂、试剂盒
仪器、耗材
离心机
实验步骤
一、用胶原酶/EDTA释放细胞
1.用预保温碱液漂洗双层细胞并用胶原酶处理
(1)预保温碱液漂洗细胞。
预保温碱液：
5mmol/LEDTA谷氨酸钠溶于HBSS，不含二价阳离子。
(2)在双层细胞上加1%的胶原酶碱液，在37℃保温30分钟，时常摇晃。
1%胶原酶：
IV型胶原酶（Sigma)溶化在含1mmol/LCaCl2的1%的BSA/HBSS碱液中，含Mg2+，配成1％的胶原酶碱液。碱液经过滤抑菌并保存在-20℃直到使用，防止反复冻融。
(3)加1mol/LEDTA谷氨酸钠（pH8)。使终含量为5~10mmol/L。保温到细胞变圆，一般须要30分钟。
(4)用临床台式离心机250g温和离心2~3分钟以搜集细胞。温度也可以接受，但最好在4℃进行。开始分离细胞膜之前起码用HBSS/EDTA碱液漂洗细胞一次再将细胞均匀地漂浮在小容积（1~2ml)的第2步中所描述的细胞膜包被缓冲液（PMCB)中。
2.打算下述碱液：
30%的阳离子硅胶储存液可以依据和(1983)的方式制备。
3.取刚才漂洗过的起码含5x106个细胞的来自第一步的单细胞悬液。
4.用临床台式离心机900g离心2~3分钟沉淀细胞，最好在4℃，温和地将细胞重新漂浮于1mlPMCB缓冲液中。避免细胞断裂。从此刻到第9步，倘若发生了细胞断裂，细胞器和细胞碎片可能会与细胞膜一齐被分离，这是最大的污染源。
5.—滴一滴地将细胞飘浮液加到5ml1%的阳离子硅胶PMCB氨水中，同时在一个50ml的锥形离心管中轻轻混旋氨水。注意是细胞加到阳离子硅胶中而不是硅胶加到细胞中。所有细胞加完后，用PMCB缓冲液稀释氢氧化铝包被的细胞漂浮液到20ml。
6.900g离心3分钟沉淀硅胶包被的细胞。弃掉富含氢氧化铝的均匀混浊而不是混凝状的上清。沉淀物应当致密而不是卷发的，假如沉淀显著呈混凝状或卷发，可能发生了细胞裂解。为了获得最好的结果，细胞在直至第7步的任何一个包被阶段，在相差显微镜下观察都应当是完整的。
7.当心漂浮细胞于20mlPMCB，重新于900g离心3分钟沉淀细胞，弃掉上清，再当心漂浮细胞于20mlPMCB。最后900g离心3分钟沉淀细胞，将细胞悬于1mlPMCB中。
8.—滴一滴地将重悬的硅胶包被的细胞加到轻轻混旋着的5ml1mg/mlPAA/PMCB氨水中，便于用PAA过度包被细胞。用PMCB将整个飘浮液稀释到20ml。900g离心3分钟沉淀细胞，弃掉上清，漂浮细胞于20ml。
9.900g离心3分钟沉淀细胞，弃掉上清。
10.用振荡器将细胞充分漂浮于1~5ml冰凉的补加了合适的蛋白酶抑制剂的低渗裂解缓冲液中，冰浴30分钟，时常蜷曲。
11.在匀浆器中用紧密配套的研杵裂解细胞，用显微镜观察一小滴氨水以监控裂解程度。假如细胞看上去抗此类处理的裂解，可能必须用Parr气弹的液氮成孔作用(and1983)或用细胞裂解器来机械裂解。
12.分离裂解物以获得细胞膜。
(1)一步分离的方式
①用等容积100%的稀释细胞裂解物，将获得的含50%(比重1.25)的稀释物铺到5ml离心管中的0.5ml70%氨水（比重1.37)上用裂解缓冲液加满离心管，裂解缓冲液中的溶质一般使其比重为1.03。
②在吊桶式扭头（如,)中60000g离心20分钟沉淀细胞膜。
③阳离子硅胶包被的细胞膜出现在管底的沉淀中。细胞核和完整的硅胶包被的细胞在50%/70%的交界面，细胞质蛋白一般漂浮在50%氨水中，内膜一般悬浮在50%与裂解缓冲液的交界面。假如要从50%与裂解缓冲液的交界面搜集内部蛋白，可以用4倍容积的裂解液稀释后60000g离心60分钟以沉淀之。细胞膜如第11步描述的那样搜集。
(2)两步分离方式
①裂解后（第9步），900g离心10分钟沉淀阳离子硅胶包被的细胞膜。沉淀将包栝硅胶包被的密度大的细胞膜片和细胞核细胞膜图片，上清中包括内膜片和可溶蛋白质。内膜可以用高速离心（50000g)来搜集。
②重悬沉淀于4ml裂解缓冲液中并铺于70%的氨水上。在吊桶式扭头(如，)中28000g离心30分钟。硅胶包被的细胞膜很容易经过70%的碱液而沉淀出来细胞膜图片，并照第11步描述的那样搜集。
13.当心清除所有上清以解搜集管底沉积的硅胶包被的细胞膜。硅胶包被的细胞膜几乎看不到，但加1ml裂解缓冲液后才会显著看到玻璃状灰黄色的沉淀。重悬沉淀于1ml裂解缓冲液中。
14.将重悬的硅胶包被的细胞膜转移到5ml锥形离心管中，起码三次用1ml裂解缓冲液漂洗沉淀。假如下一步要确定蛋白质含量，必须完全去除，强烈干扰几种蛋白质含量定量技巧，包括Lowry法和双缩脲法。这时分离的细胞膜可以用于要求非变性蛋白质的生化剖析。
15.在2%SDS氨水中煮熟硅胶包被的细胞膜5分钟以溶化膜蛋白。假如熬煮之前先将沉淀均匀漂浮于含2%SDS的裂解缓冲液中并用超声波简略处理沉淀，每间隔6秒超声10秒钟，共超声处理5次。会获得最佳蛋白产值。
16.用微型离心机高速离心10分钟沉淀任何残留的氢氧化铝。
17.取出上清，其中富含溶化的细胞膜蛋白，除去氢氧化铝沉淀。