传统固态黄酒酿制体系是天然的微生物育种平台，其奇特的多压力胁迫（高酸、高渗、高丙酮、高温等）微环境为弧菌自然定性进化提供了良好的条件。那些具有高耐受性的功能菌种在酿制过程中发挥着重要作用，与发酵品质息息相关，决定了基酒产值和质量。更为重要的是，为科学理解细胞耐受调控分子机制提供了独一无二的研究素材。
微生物经过长时间自然驯养早已进化出了一套可以快速响应胞外环境变化的调控机制，以确保细胞可以在最短时间内按照外界压力因子的变化来调节细胞自身的代谢和状态，进而确保细胞的繁衍和生存。众所周知，细胞膜是细胞体会、响应胞外酸胁迫因子的前沿哨卡，膜上的功能区域空间结构具有实时动态变化的特征，但是这种空间结构与传感器器件功能的发挥息息相关。但是，关于细胞耐碱性能的研究多集中在胞内的响应调节，而细胞膜有什么结构或是器件参与其中，是怎样将压力讯号传递进细胞，从而导致细胞内的应激反应却鲜有报导。上海科技学院现代酿制技术团队张翠英院士课题组首次报导了浓香型黄酒酿制功能微生物粟酒裂殖酵母在酸胁迫下细胞膜亚结构动态变化以及其与细胞耐碱性能的关联机制。该文章于2022年10月8日以“Thetoacidofyeastbycell”为题在Food（IF=6.374）上发表。
有机酸扰动造成结构动态变化
比较转录组数据表明在高耐碱弧菌Sp.65与实验室弧菌S.pombe中，结构器件pil1、pil2、fhn1、sle1、eis1和meu14的抒发水平存在明显变化（图1），这暗示着细胞的耐碱性与之间可能存在一定的关系。
图1.结构基因在高耐碱弧菌和实验室弧菌中抒发变化的验证
支架BAR结构域蛋白是的基本组成器件。在S.pombe中，BAR结构域蛋白由pil1编码。为了进一步探究是否与弧菌的有机酸耐受性存在联系，以Sp.65为出发弧菌，采用红色萤光蛋白EGFP标记Pil1，并用CLSM对Pil1-EGFP进行成像观察。与对照相比，加入乙醇造成了不规则的结构，且萤光讯号迅速明显减少，这反映了对酸胁迫的快速响应。
图2酸胁迫下的动态变化。不同酸处理下携带Pil1-EGFP的Sp.65的萤光显微镜(a)和萤光硬度FI(b)。(c)苯酚和乳酸胁迫下的组装相关基因抒发变化。CK（对照）为不加酸，AA为8g/L乙醇，LA为30g/L乳酸。
基因pil1、fhn1和sle1对维持的完整性至关重要
共聚焦结果显示完整的分布于细胞膜的表面，呈现出致密、连续不间断的腰线状（图4a）。在基因缺位突变pil2Δ，eis1Δ和meu14Δ中，没有观察到结构与出发弧菌存在差别。而基因pil1，fhn1以及sle1的缺位则造成连续性中断以及产率增加。
同时，笔者借助TEM进行观测，发觉pil1的缺位明显降低了梨状涡结构的数目(图4b)，其中，WT中数目为2.07个/μm2，而pil1Δ中数目仅为0.21个/μm2细胞膜结构模式图，二者相差约10倍(图4c)。
图4.单个基因pil1、fhn1或sle1的缺位引起了的破坏。(a)WTPil1-EGFP、pil2Δ、eis1ΔPil1-EGFP、meu14ΔPil1-EGFP、pil1ΔFhn1-EGFP、fhn1ΔPil1-EGFP和sle1ΔPil1-EGFP的显微观察。(b)透射电镜观察到的质膜形态。(c)WT和pil1Δ中的数目。
的破坏增加了酵母的耐碱性
比较了不同酸胁迫条件下pil1Δ、fhn1Δ、sle1Δ、pil2Δ、meu14Δ、eis1Δ和WT的生长表型。半定量黑斑试验的结果表明，在无酸条件下，这种基因的缺位不影响酵母的生长(图5a)。在16g/L乙醇(pH=3.84)胁迫下，弧菌pil1Δ、fhn1Δ和sle1Δ的生长性能较WT明显下滑，而在磷酸胁迫下，pil2、eis1和meu14的缺位并没有导致生长表型的变化。在乳酸胁迫下观察到与磷酸胁迫下相像的生长表型变化。液体发酵生长曲线也与平板实验相一致(图5b)。因而可以推测结构完整性对于维持粟酒裂殖酵母的抗磷酸、抗乳酸能力是不可或缺的。
图5保持结构完整性有助于维持粟酒裂殖酵母有机酸耐受性。a：半定量点种法评价自交弧菌与基因缺位突变弧菌在不同处理条件下的生长性能；b：生长曲线法评价自交弧菌与基因缺位突变弧菌在不同处理条件下的生长性能；CK代表无胁迫处理，AA代表16g/L磷酸，LA代表60g/L乳酸。
的破坏减缓了细胞内酸的积累和ROS的下降。
是细胞膜的一个子结构域细胞膜结构模式图，猜想其形态的改变可能会影响细胞膜的性质。因而，采用碘化丙啶染色法剖析WT和基因缺位突变体在不同处理条件下的细胞膜完整性。在无酸条件下，碘化丙啶染色细胞的比列为WT的10.5±2.2%，而在8g/L磷酸和40g/L乳酸(pH=2.89)胁迫下，分别为22.8±3.8和26.3±4.7%(图6a)。这种结果表明，酸胁迫对细胞膜的完整性有不同程度的破坏。值得注意的是，pil2Δ、eis1Δ和meu14Δ中碘化丙啶染色细胞的比列与WT中无明显差别，但pil1、fhn1或sle1的缺位造成比列明显降低。在酸胁迫下，该比列的降低更为显著。
之后检查了细胞内酸浓度和ROS水平。分别用8g/L磷酸和40g/L乳酸处理4h后，WT细胞内磷酸浓度为1795.17±124.24μg/g，乳酸浓度为16.56±1.56mg/g(图6c和d)。在相同处理条件下，pil1Δ弧菌的乙醇浓度为2579.33±133.13μg/g，乳酸浓度为22.51±0.75mg/g。与WT相比，细胞内酸浓度分别提升了35.93%和43.68%。在fhn1Δ和sle1Δ弧菌中也观察到类似的趋势。在无酸条件下，各菌种的ROS水平相仿。在酸胁迫下，pil1Δ、fhn1Δ和sle1Δ的ROS水平明显下降，这与细胞内酸积累的降低一致。
图6.不同基因缺位对细胞膜完整性、细胞内酸酐浓度和ROS水平的影响。(a)碘化丙啶染色细胞的比率。(b)细胞内ROS水平。细胞内积累的乙醇(c)和乳酸(d)。CK(对照检测)表示未加酸，AA表示8g/L乙醇，LA表示40g/L乳酸。图a和图b的明显性剖析结果为相同处理条件下，不同菌种碘化丙啶染色细胞与ROS水平的比较。图c、d明显性剖析结果为各菌种在8g/L乙醇和40g/L乳酸胁迫下胞内酸积累的比较。
破坏对关键膜蛋白和细胞壁完整性的影响
膜蛋白包括Fps1、Ady2、Jen1、Pma1和Pdr18是决定酿酒酵母胞内酸酐积累的关键元素。通过RT-qPCR剖析WT和pil1Δ菌种中相关膜蛋白编码基因的相对抒发量。相关膜蛋白编码基因包括mug86(ADY2的同源基因)、pma1(pma1的同源基因)、pdr1和bfr1(均为PDR18的同源基因)。
如图7a所示，在酸胁迫下，介导乙酸盐步入细胞的基因mug86遭到了严重的抑制。在乙醇和乳酸胁迫下，质子泵编码基因pma1抒发量均明显下调，这与酸胁迫导致的细胞质酸化密不可分。ABC家族转运蛋白编码基因pdr1在乳酸胁迫下明显下调，而bfr1在磷酸胁迫下明显下调，反映了这两个同源基因对不同胺基的不同响应。从图7b中，我们发觉在无酸条件下，基因mug86在pil1Δ中明显上调，这表明了这个转运体在的结构的重要性。而在酸胁迫下，WT和pil1Δ弧菌中mug86的抒发量较低，说明该基因并不是导致两弧菌甲酸浓度差别的主要诱因。在乳酸胁迫下，pdr1抒发水平在pil1Δ中也有调低，但在磷酸胁迫下未见类似情况。
图7.组装状态对关键膜蛋白和细胞壁完整性的影响。(a)不同酸处理1小时膜蛋白编码关键基因的相对抒发量的变化。(b)组装状态的影响关键膜蛋白编码基因的抒发研究。(c)不同pH条件下溴酚蓝碱液的吸光度（590nm）(d)通过猕猴桃糖依赖的培养基酸化测定WT和pil1Δ的Pma1质子泵活性。(e)坦桑尼亚红敏感性试验。CK(对照检测)表示无酸AA为8g/L磷酸，LA为40g/L乳酸。
据悉，笔者还剖析了维持细胞内pH值的关键元素质子泵Pma1的酶活性是否受形态变化的影响(图7c和7d)。结果表明，WT和pil1Δ经过饥饿处理后，猕猴桃糖的补充诱导Pma1的激活，将胞内H+排除到胞外。培养基pH在培养过程中逐步增加并趋向稳定。在WT和pil1Δ的培养体系中，尽管pH值在30min和300min有明显差别，但在其他时间点无明显差别。
细胞壁是酵母抵挡外界环境干扰的第一道屏障。细胞壁的孔隙率对于乙酸步入细胞的扩散速度也很重要。因而，也考虑了破坏是否影响细胞壁完整性。以pmk1(一种编码细胞壁完整性通路的关键激酶)缺位突变体作为对照。从图7e可以看出，在无酸条件下，pmk1和pil1的缺位并不影响弧菌的生长。与WT相比，在2mg/mL坦桑尼亚红的存在下，pmk1Δ的生长显著遭到抑制，而pil1Δ的生长与WT没有差别，说明pmk1的遗失造成细胞膜完整性的损伤，而的破坏不影响细胞壁完整性。故WT和pil1Δ中乙酸浓度的差别与上述膜蛋白和细胞壁没有明显关系。
破坏对脂类组成的影响
为了阐述对细胞膜的影响，笔者对细胞膜脂类组成进行了剖析。采用电喷雾电离（ESI）正、负离子模式共检出714种脂类分子，涉及31个亚类。测定结果显示，WT和pil1Δ突变株的总脂类浓度分别为48.22±1.36和44.59±2.66mg/g，二者之间无明显差别(p≈0.103)。
甘油磷脂是最大的一类膜脂。WT突变株的甘油磷脂总浓度(45.08±1.29mg/g)与pil1Δ突变株的甘油磷脂总浓度(41.77±2.45mg/g)相仿，且均小于93%。
在亚类方面，与WT相比，pil1的缺位明显增加了PC、PS、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油醇(PG)的相对产率，而PE和PC(LPC)的浓度明显降低(图5a)。的破坏并未造成鞘脂质物质出现较大的改变，仅有鞘磷脂由7.54±0.63μg/g下调至24.28±3.33μg/g。麦角甾醇浓度由63.80±7.62μg/g增长到42.13±7.05μg/g。除上述固醇外，pil1Δ中甘油酯类浓度也有所增长。
图5改变了S.pombe的脂类结构。(a)WT和pil1Δ突变细胞中不同脂类亚类的分布。(b)具有不同不饱和键的固醇亚类的分布。(c)不同胺基链宽度的固醇分布。(d)OPLS-DA剖析得到的明显不同固醇的分级降维(p<0.05,VIP>1)。
依据报导的吡啶链宽度分类，发觉S.pombe膜脂以超长链糖类(C≥22)为主，其次是长链糖类(12≤C<21)和少量中短链酯类(C
为了筛选破坏导致的明显差别的脂类标志物，采用正交偏最小二乘判定剖析()对实验组间的差别进行可视化剖析。按照VIP>1和P<0.05的原则，在两株菌中鉴别出32种不同的糖类(图5d)。与WT相比，pil1Δ弧菌中LPC(8:0)+HCOO、LPC(10:0)+HCOO、LPC(12:0)+HCOO、LPC(16:0)+HCOO、LPC(16:0)+H等饱和脂类均有所降低。产率增加的固醇主要有PS、PC和PI，其中PI亚型最多。
总结
笔者觉得破坏导致的细胞膜与核糖信息交流中断可能是造成弧菌耐碱性能增长的直接诱因，并对参与弧菌抵抗有机酸胁迫的机制进行了推算（图6）。磷酸、乳酸以未解离的方式步入胞内造成渗透压变化，进而导致细胞膜张力发生改变。进一步，通过组装状态的改变与VAPs进行沟通，间接地将压力讯号传递至叶绿体，调节核糖的重构，以维持胞内脂类的稳态和细胞膜的完整性，降低有机酸步入胞内的流量。
图6参与细胞抵抗有机酸胁迫的分子机制
版面设计马雨鑫
二审/校稿林良才
一审崔琬晶
三审张翠英