1、山东学院实验报告2014/11/18姓名：XXX系年级：20XX级齐鲁医学班学号：课目:细胞生物学实验实验题目:内质网的分离及萤光观察内质网的分离及萤光观察【实验目的】1.学习使用差速离心法获取内质网2.通过动物细胞内质网的分离，了解细胞器分离的通常原理和技巧。3.观察内质网的自发萤光和次生萤光，并熟悉萤光显微镜的使用技巧。【实验原理】1.高等动物中内质网象双凸或平凸透镜，长径510um，短径2-4um，厚2-3um。高等动物的叶肉细胞通常含50-200个内质网，可占细胞质的40%。、叶绿体的数量因物种细胞类型，生态坏境，生理状态而有所不同。在绿藻中
2、叶绿体形状多样，有网状，带状，裂条状和星形等等，但是容积巨大，可达100um.内质网由内质网外被，类囊体和基质3部份组成。内质网富含3种不同的膜：外膜，内膜，类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙，基质和类囊体腔。2.匀浆破碎细胞，借助差速离心方式分离等渗介质中的漂浮颗粒。搜集类内质网大小的颗粒，得到内质网。差速离心法：颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及漂浮介质的黏度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次降低离心力和离心时间，就才能使非均一漂浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管顶部分批搜集即可获得各类亚细胞组分。叶
3、绿体的分离应在等渗氨水(0.35mol/L硝酸钠或0.4mol/L蔗糖碱液)中进行，以免渗透压的改变使内质网遭到损伤。分离过程最好在05的条件下进行：假如在温度下，要迅速分离和观察。3.差速离心法特征：介质密度均一；速率由低向高，逐级离心用途：分离大小相差悬殊的细胞核细胞器沉降次序：核内质网，线粒体溶酶体与二溴化物体核糖与高尔碳化物核蛋白体可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。【实验材料】1.试剂：0.35mol/L硫酸钠碱液，0.01吖啶橙。2.用具：粗天平、组织磨碎机、普通离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜、500ml烧瓶、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布
4、若干，试管架、无萤光载玻片和盖玻片。3.材料：新鲜豇豆。【实验步骤】1.选定新香浓滤莴苣叶，除去叶梗及粗脉，沥干擦掉生物观察叶绿体实验视频，称30g于.35mol/LNaCI氨水中；2.将叶和液同放入组织磨碎机中，匀浆3-5min，怠速5000r/min；3.将匀浆液用6层纱布过滤到500ml烧瓶中；4.取上清液4ml在1000r/min下离心2min；5.取下层清液在3000r/min下离心5min（沉淀为内质网和细胞核混和物）；6.将沉淀用2-3ml0.35mol/L硝酸钠液漂浮；7.取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下观察。8.另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%吖啶橙萤光颜料，混匀，盖上
5、盖片后，在萤光显微镜下观察。【实验结果】普通光学显微镜下对内质网的观察图表1普通光学显微镜下莴苣叶的内质网（10*40）普通光学显微镜下可看见：番茄内质网呈红色的橄榄形由于离心不当，带有一定量的杂质图表2普通光学显微镜下内质网局部放大图（10*40）仔细观察可看见基粒深红色的小颗粒萤光显微镜下的内质网图表3萤光显微镜下未被染色的内质网（10*40）萤光显微镜下可观察到：未被染色的内质网自发萤光为火绿色，呈片状分布，其他部份为白色。图表4萤光显微镜下已被染色的内质网（10*40）吖啶橙染色后萤光显微镜下，对内质网的观察：内质网可发出桔黄色萤光。其中混有的细胞核则发红色萤光其他大部份，
6、背景为红色。【实验结果剖析】1.普通光学显微镜下观察到的内质网呈红色橄榄形，高倍镜下仔细观察可见到内质网内部富含深红色的小颗粒基粒。另外还可以观察到形状较小且不规则的组织碎片，这是由于在离心过程中，由于离心不彻底导致内质网沉降物中富含其他组织碎片。2.萤光显微镜下，内质网自发萤光为“火绿色”，次生萤光为“桔黄色”。3.未染色的玻片在萤光显微镜下观察，内质网为“火绿色”，呈片状分布，且背景为蓝色。这是由于内质网自身在悬液中呈片状分布，而且其中的叶绿素在经过迸发光波照射后，可放出火白色的自发萤光，而且悬液中的其他成分不发生萤光反应4.染色后的玻片在萤光显微镜下观察，内质网为“桔黄色”，其中
7、混有的细胞核碎片中富含的核苷酸在吖啶橙的作用下呈红色。背景空白处为红色，这是由于载玻片有杂质。【实验注意事项】1.萤光显微镜有两套光源系统，先在自然光源下调整好观察视野，再切换到萤光光源观察。2.要注意正确的使用萤光显微镜：（1）不要直接观察迸发光源，保护双眼（2）萤光颜料有一定毒性，要做好防护（3）观察萤光受多种诱因的影响，如体温、光、淬灭剂等（4）在萤光观察时应抓紧时间，立刻照相，避免萤光会发生淬灭，导致整体肿胀。（5）萤光显微镜不能随便开关，汞灯开启15分钟之内不能关掉。3.内质网的分离应在等渗碱液（0.35mol/LNaCl）中进行，以免渗透压的改变使内质网受损伤；4.制做装片
8、，滴加悬液时，先用吸管吹匀悬液，滴客场，不能滴加太多，若滴加过多的话，则用滤纸片汲取多余液体，否则，观察目标在镜头下悬浮，不便捷观察。5.吖啶橙可染细胞核，对人体害处比较大，不能用手直接接触。6.离心管必须等量生物观察叶绿体实验视频，对称地装入离心机中；7.分离结束后，先关掉离心机，在离心机彻底停止转动后，才可打开离心机，取出试样。8.差速离心法不能得到完全纯净的内质网，要想获得更纯的内质网，可以用密度梯度离心法。9.制片时注意所取的悬液尽量适量，保证视野中的内质网的数目。【实验反省】1.内质网的稀释倍数要恰当，数目太少在萤光显微镜下无法观察到。我们组一开始制做的玻片中由于内质网数目太少，在萤光显微镜下几乎观察不到内质网的存在；2.通过此次试验，我较为清楚的晓得了萤光的相关概念和萤光显微镜的使用方式及相关注意事项，晓得了之后步入实验室，必须具备优厚的知识和熟练的操作技能，这样就能将实验弄成功。