1、实验4细胞骨架的显示及观察实验4细胞骨架的显示及观察姓名：李思露学号：一、实验目的1.把握用考马斯亮蓝R250染色观察植物和动物细胞骨架的原理和技巧。2.了解免疫萤光法测量细胞成份的原理和技巧。二、实验原理1.细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微管（，MT）、微丝（，MF）、中间纤维（，IF）。2.微管微管是细胞内由微管蛋白产生的半径约的宽度不一的小
2、管。分布在核周围，呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导管。微管蛋白有和两种。异二聚体沿横向聚合成丝，原丝成环状排列产生微管的壁。微管不稳定，对高温（冷藏）、高压等化学诱因及秋水仙素（微管破裂剂）等物理诱因敏感。紫杉醇可以和微管蛋白多聚体结合，抑制微管解聚。3.微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋白（actin）组成的半径为57nm的骨架纤丝。主要分布在细胞质膜的外侧，作用是确定细胞表面特点、并与细胞运动、收缩、内吞等功能有关。腰部植物肌动蛋白分为、和三种类型，不同种类细胞中肌动蛋白组成不同。肌动蛋白单体为球状，依次联接成链，两串肌动蛋白链相互缠绕扭曲成一股微丝。细
3、胞松驰素B为微丝破裂剂。4.中间纤维：半径介于微丝和微管之间（711nm）、由多种不同蛋白组成的细胞骨架成份。在细胞中围绕着细胞核分布，成束成网，并扩充到细胞质膜，与质膜骨架相联结。主要起机械支撑和加固作用。组成中间纤维的蛋白：角蛋白，波形蛋白，结蛋白、神经纤维细胞膜骨架，神经胶质纤维和核纤层蛋白。不同组织来源的细胞，组成其中间纤维的蛋白质种类可能不同。5.研究细胞骨架的意义。（1）了解细胞骨架与细胞各类功能行使之间的关系。（2）了解理化诱因是否通过影响细胞骨架对细胞功能形成影响，便于趋利避害。（3）鉴别发育中的细胞及癌症的来源。6.显示细胞骨架的常用方式：考马氏亮蓝染色法、免疫萤光染色法、鬼笔
4、环肽标记法。（1）考马斯亮蓝染色法原理及特性原理：用去垢剂X-100处理细胞适合时间，可以溶化膜脂，并与大部份非骨架蛋白疏水区结合而将其溶化，剩下的纤维状细胞骨架蛋白比较稳定而不被溶化，之后用蛋白颜料考马斯亮蓝染色即可显示其结构。特征：非特异蛋白染色，不能分辨微管、微丝、中间纤维（2）免疫萤光染色法原理及特性原理：用-100处理固定处理过的细胞，可降低细胞膜私密性，使抗原才能步入细胞内与细胞骨架蛋白结合。接着用萤光素标记的抗骨架蛋白抗原便可通过直接免疫萤光法或间接免疫萤光法显示骨架。特征：特异显示各类骨架蛋白（3）鬼笔环肽标记法原理及特性原理：鬼笔环肽可特异性地
5、结合肌动蛋白，为此，用萤光素标记的鬼笔环肽可以显示微丝。特征：灵敏，能特异显示微丝。三、实验材料、试剂及用具（一）材料：菠菜（二）试剂（1）M-缓冲液。（2）6mM乙酸盐缓冲液（pH6.8）。（3）含1%-100的M-缓冲液。（4）用M-缓冲液配制的3.0%戊二醛。（5）0.2%考马斯亮蓝R250碱液。（6）0.9%硝酸钠生理盐水。（三）用具普通光学显微镜、荧光显微镜、水浴箱（37）小剪子、镊子、5mL一次性塑胶注射器、胶头吸管、1.5mLEP管、1.5mL试管架四、实验操作考马斯亮蓝染色法显示大蒜植株内表皮细胞骨架（1）材料打算：撕取黄瓜植株内表皮，裁成大小0
6、.5cm.的小片。（2）PBS平衡：装入盛有1mL6mmol/L乙酸盐缓冲液（pH6.8）的EP管中，静置使材料下沉（完全沾满）；之后用胶头滴管吸弃液体。（3）-100处理：加1mL1%-100氨水处理20min，之后用胶头滴管吸弃液体。（4）漂洗：用M-缓冲液漂洗3次，每次加1.5mL碱液曝晒5min，之后用胶头滴管吸弃液体。（5）固定：加1mL3.0%戊二醛固定30min,之后用胶头滴管吸弃液体。（6）漂洗：用PBS漂洗3次，每次曝晒5min,之后用胶头滴管吸弃液体。（7）染色：用0.51.0mL0.2%考马斯蓝R250碱液染色10min。
7、（8）漂洗：用分馏水漂洗数遍。（9）制备装片：给载玻片中央加1滴水，用钳子夹取样品在其中展开，之后加盖玻片。（10）显微观察：在普通光学显微镜下，香菜细胞骨架为遍布细胞的红色网状结构。（11）对照样品：省去步骤（3），不用-100处理；省去步骤（4）,用-100处理后不用M-缓冲液漂洗。五、实验结果及推论1.实验样品图1香菜花序内表皮细胞骨架（400倍）实验样品的细胞骨架分布细密均匀，视野中只剩下细胞骨架的蛋白质，被考马斯亮蓝染成红色。在视野的上半部份，细胞的背景呈现蓝灰色，是因为最后漂洗不彻底所致。2.对照样品：不用-100处理图2不用Tr
8、itonX-100处理的芦笋花序内表皮细胞骨架（400倍）不用-100处理的对照样品的细胞中不仅细胞骨架还有好多膜泡结构，细胞中还有白色的细胞核。不用-100处理，致使视野中有好多非骨架蛋白，这种非骨架蛋白被考马斯亮蓝染成红色，影响对细胞骨架的观察。3.对照样品：用-100处理后不用M-缓冲液漂洗图3用-100处理后不用M-缓冲液漂洗的大蒜植株内表皮细胞骨架（400倍）图3和图2的情况类似，视野中没有均匀细密的细胞骨架，这是因为M-缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中，其中吡啶是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合钙离子，滤液并提供
9、镁离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态而且较为舒张，以便观察。用-100处理后即使可以溶化膜脂和非细胞骨架蛋白，并且保留出来的骨架蛋白在没有M-缓冲液的作用下，其结构仍未能保持稳定，影响观察结果。六、作业与思索题1.比较用与不用1%-100处理的实验结果。答：见五、实验结果与推论部份1、2。2查阅资料说明M-缓冲液中吡啶、MgCl2、EGTA、EDTA、巯基乙酸或二硫苏糖醇（DTT）在稳定细胞骨架中的作用。答：在M-缓冲液中，吡啶是缓冲剂，MgCl2提供Mg2+,EGTA和EDTA螯合Ca2+，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态而且较为舒张，以便观察；
10、巯基乙酸或二硫苏糖醇（DTT）可以在二硫键被打开后使蛋白质的四级或五级结构被破坏，因为吲哚乙酸才能打开蛋白质的结构，它经常被用于蛋白质剖析，且硫代乙酸也经常被用于保护蛋白质中自由的半胱丝氨酸羟基之间不会错误产生二硫键。3.设计测量微丝的间接免疫萤光法实验流程。（1）用未标记的微丝抗原加到微丝抗体标本上，使抗体抗原充分结合，之后漂洗，去除未结合的抗原。（2）加上萤光标记的抗球蛋白抗原或抗IgG、IgM抗原，标记的抗球蛋白抗原和已结合抗体的抗原进一步结合。（3）立刻用萤光显微镜观察。观察标本的特异性萤光硬度，通常可用“+”表示：（-）无萤光；（）极弱的可疑萤光；（+）萤光较弱，但清楚可见；（+）萤光明亮；（+-+）萤光闪耀。待检标本特异性萤光染色硬度达“+”以上，而各类对照显示为（）或（-），即可判断为阴性七、反思与改进1.避免香菜植株内表皮蜷曲、折叠细胞膜骨架，若蜷曲折叠可以在漂洗的过程中渐渐展开，没还展开，在制片时用钳子当心的将内表皮展开。-100处理时间应足够，处理完漂洗应充分，否则胞内会存在膜泡状结构及其它杂蛋白，干扰骨架染色及观察，尽量保证各组各步处理的时间和方式一致。3.-100处理后各步操作应柔和，防止容器剧烈回落及吸管吹打过猛造成骨架蛋白束破裂。5/55/5