约30％的编码基因编码的膜蛋白（MPs）在诸多生理过程中起着至关重要的作用。膜蛋白是超过FDA批准抗生素一半的靶标抗生素。须要在近乎生理条件下对功能性膜蛋白进列宽码率的结构研究，以提供深入的机理理解并推动抗生素发觉。随着单粒子冷藏显微镜（cryo-EM）的帧率革命，分离的膜蛋白的结构阐释已取得了快速进展。下一个挑战是保留电物理梯度和膜曲率，便于对膜蛋白进行全面的结构阐释，而膜蛋白的生物学功能依赖于这种物理和数学特点。
2020年7月17日，颜宁团队在PNAS在线发表题为“Cryo-EMofainthe”的研究论文，该研究以特点明晰的AcrB为原型，提出了一种便捷的工作流程，用于对嵌入脂类体中的膜蛋白进行冷藏-EM结构剖析。结合优化的蛋白脂类体分离，冷藏样品制备和有效的颗粒选择策略，以3.9的帧率获得了嵌入脂类体中的AcrB的三维（3D）重建。该研究方式可广泛应用于具有奇特可溶性域的膜蛋白的冷藏EM剖析，为功能受跨膜电物理梯度或膜曲率影响的整体或外围膜蛋白的冷藏EM剖析奠定了基础。
另外，2020年6月15日，颜宁及杨洪远共同通信在Cell在线发表题为“BasisofLow-pH-byNPC1andNPC2”的研究论文，该研究阐明了低pH依赖性固醇从NPC2传递到NPC1跨膜（TM）域的分子基础。在pH8.0时，在纳米光碟和去污剂中分别获得3.6和3.0码率的NPC1类似结构，阐明了联接N端结构域（NTD）和跨膜胆固醇传感器结构域（SSD）的隧洞结构；在pH5.5时，NTD表现出两个氢键，表明固醇向隧洞输送的运动。在通道的膜边界发觉了一个假设的固醇分子，TM2向SSD上的表面袋产生。最后，在pH5.5时获得了帧率为4.0的NPC1-NPC2复合物的结构，揭示了尿酸从NPC2转移到NPC1（NTD）的分子基础。
2020年6月8日，颜宁团队在PNAS在线发表题为“forcryo-EMoftoxinon-gatedNa+in”的研究论文，该研究介绍在漂洗剂络合物和纳米圆盘中的单粒子冷藏电子显微镜（cryo-EM）剖析。在两种条件下，的构型与潜在灭活的NavAb的构型几乎相同。确定纳米光碟中的结构使研究人员才能检测脂类单层中Nav通道的门控修饰剂毒素（GMT）。为了研究喂奶植物Nav通道中的GMT，该研究生成了一个嵌合体，其中Nav1.7的第二个电流感测域中S3和S4区段的细胞外片断替换了中的相应序列。此解决方案可实现毒素对接的可视化。为此，可以用作膜环境中GMT与Nav通道之间互相作用的结构研究的方便代替品。
2020年5月13日，颜宁等团队在在线发表题为”basisforandofhumanACAT1“的研究论文，该研究介绍了人类ACAT1的冷藏电子显微镜结构。每位都由九个跨膜段组成，这种段包围了一个胞质通道和一个在预计的催化位点会聚的跨膜通道。结构指导的突变剖析的证据表明，乙酰辅酶A通过细胞质通道步入活性位点，而尿酸可能从侧面通过跨膜通道步入。这些结构和生化特点有助于合理化ACAT1对不饱和羰基链的偏好，并提供对MBOAT家族中酶催化机制的看法。
2020年5月13日，颜宁等团队在在线发表题为”andofhuman-“的研究论文，该研究介绍了人类DGAT1的冷藏电子显微镜结构。每位DGAT1都有9个跨膜螺旋，其中8个产生保守的结构折叠，将其命名为MBOAT折叠。DGAT1中的MBOAT折叠在膜中产生一个中空腔室细胞膜糖蛋白，该腔室包围着高度保守的催化残留物。该腔室有两个底物，脂肪硝基辅酶A和二甲基甘油的单独入口。DGAT1可以同型二聚体或同型四聚体方式存在，两种方式具有相像的酶活性。DGAT1的N末端与毗邻的互相作用，而这种互相作用是酶促活性所必需的。
生物膜包围着拓扑隔离的隔室，包括细胞和细胞器，并为各类完整的和外围的膜蛋白（MP）提供了栖居地。这种化学屏障使生命必需的电物理梯度得以生成和维持，这是因为离子和物理物质在整个不可渗透膜上的不对称分布所致。各类生理过程都取决于这种梯度，比如由质子梯度（质子动力）驱动的三乙酸腺苷（ATP）合成和依赖跨膜电场存在的动作电位。为此，许多膜蛋白，比如电流门控离子通道（VGIC）以及一级和二级活性转运蛋白，都依赖于跨膜电物理梯度来执行其生物学功能。
不仅留驻在膜的内部或表面之外，膜蛋白与膜之间的互相作用也对细胞寿命形成了深远的影响。诸如，许多外周膜蛋白定义了细胞器产生的膜轮廓。FoF1ATP合酶的二聚化在打造线粒体中起着重要作用。机械敏感通道通过部份由膜变型施加的机械力控制。
当X射线晶体学是确定结构的主要方式时，解析膜蛋白的结构以前极具挑战性。必须从断裂的膜中纯化出高度均质的膜蛋白，并用悉心选择的去污剂替代以结晶。自2013年以来，冷藏电子显微镜（cryo-EM）单颗粒剖析（SPA）已成为膜蛋白高帧率结构解析的主流手段。已应用多种试剂将膜蛋白溶化为单个颗粒以进行剖析。不仅去污剂微团外，两亲，纳米圆盘和苯乙烯-马来酸脂类颗粒（SMALP）封闭的带有天然膜的纳米圆盘也已用于成功的膜蛋白冷藏-EM结构剖析。
虽然取得了这种进步，但所有上述膜蛋白分离方式都破坏了膜的拓扑结构，虽然在SMALP环绕的带有天然膜片的纳米盘的情况下，也清除了任何现有的电物理梯度和膜曲率。为了保留那些重要特点，使用电子冷藏断层扫描（cryo-ET）的原位结构剖析可能是最终的解决方案。但是，当前的技术障碍制止了使用cryo-ET的高帧率原位结构测定。另一种取代策略是研究嵌入脂类体中膜蛋白的结构，该结构已广泛用于膜蛋白的功能剖析。
虽然使用蛋白脂类体进行了广泛的功能表征，但仅有有限的尝试将这些系统用于膜蛋白的结构阐释。在过去的六年中，早已开发了例如随机球状约束（RSC）之类的方式来研究具有改进SPA策略的蛋白脂类体系统。并且，要在两个报告中执行精确的角度分配或讯号加法，目标蛋白脂类体必须是接近完美的圆球，这是很难获得的前提条件。两种方式都还须要对原始图象进行额外的预处理步骤。
为了将cryo-EM用于嵌入或附着在脂类体上的膜蛋白的结构剖析，有必要为膜蛋白掺入，冷藏样品制备和cryo-EM数据处理开发高度可重复且便捷的工作流程。因此，研究人员选择了来自大肠弧菌的经过充分研究的耐多药转运蛋白AcrB作为方式开发的原型。质子梯度驱动的AcrB是一种三聚体，分子量约为350kDa。它是虽然在低含量和低含量下也最适于结晶的膜蛋白之一。为此，AcrB的结构是在初期确定的。到目前为止，在蛋白质数据库（PDB）中使用X射线晶体学和单颗粒冷藏EM方式测定的AcrB结构超过100种细胞膜糖蛋白，为结构验证提供了极好的参考。
在这项研究中，报告了一种工作流程，该流程具有优化的脂类体分离，高温样品制备，深层二维（2D）分类，用于数据处理。使用该研究的简化方式，获得了3.9码率的蛋白脂类体中AcrB的重建。该工作流程可轻松推广到蛋白脂类体中膜蛋白的结构测定中，并为使用蛋白脂类体系统在受控的电物理势或膜曲率存在下膜蛋白的结构剖析奠定基础。
参考消息：