一、线粒体膜电位测量原理
线粒体膜电位升高是细胞自噬初期的标志性风波细胞膜电位，发生在细胞核自噬特点（染色质浓缩、DNA破裂）出现之前，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞自噬便不可逆转。
JC-1是一种广泛用于测量线粒体膜电位∆Ψm的理想萤光探针，可以测量细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。JC-1有单体和多聚体两种存在状态，二者发射波谱不同。在正常细胞内细胞膜电位，线粒体膜电位较高，JC-1集聚在线粒体的基质中，产生聚合物，可形成蓝色萤光；自噬初期，线粒体膜电位增加，JC-1不能集聚在线粒体基质中，此时JC-1为单体，可形成红色萤光。
通过JC-1从蓝色萤光到红色萤光的转变可测量到细胞膜电位的升高，可将JC-1萤光颜色的转变作为细胞自噬初期的测量指标。常用红绿萤光的相对比例来评判线粒体去极化的比列。
JC-1单体的最大迸发波长为514nm，最大发射波长为529nm；JC-1聚合物的最大迸发波长为585nm，最大发射波长为590nm。在流式图上表现为FL1和FL2双阴性，而自噬细胞则大多为FL1单阴性。
二、线粒体膜电位测量实验操作手册
1．按照实验需求配制1×JC-1Assay和JC-1染色工作液，详见产品使用说明。稀释好的1×JC-1Assay保存在4°C。
2．阴性对照设置，详见产品使用说明；细胞根据实验方案进行自噬诱导。
3．诱导完成后的细胞，300g离心5min，弃上清，搜集细胞，PBS轻轻重悬细胞并计数。
注：良好的细胞状态是实验的关键。贴壁生长的细胞用于自噬检查时，可能会由于胰酶消化、吹打等处理造成细胞的坏死或自噬，对实验结果可能存在不可控的影响，请慎重处理。
4．取1-5×105重悬的细胞，300g离心5min，弃上清。用PBS漂洗细胞一次，离心后弃上清。
5．细胞悬液中加入500μLJC-1染色工作液重悬细胞。37°C，5%CO2培养箱中孵育15-20min。
注：培养气温与细胞类型有关，通常喂奶植物细胞建议37°C，其他种属按照细胞培养条件选择合适的体温。
6．300g离心5min，弃上清，加入500μL预冷的1xJC-1Assay漂洗2次。
7．加入500μL预冷的1xJC-1Assay重悬细胞。
8．样本放在冰上保存，30min内用流式细胞仪测量。
三、显微镜或流式细胞仪测量
A、荧光显微镜观察
1．滴一滴上述细胞悬液于载玻片，盖上盖玻片，于萤光显微镜下观察；
2．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞自噬；用PBS漂洗细胞两次；
滴加100μL1xJC-1染色工作液，加盖玻片，37℃，5%CO2的培养箱中孵育15~20min；1×JC-1Assay漂洗1~2遍；将盖玻片倒放在载玻片上，于萤光显微镜下观察。
检查JC-1单体时可以把迸发光设置为490nm，发射光设置为530nm；
检查JC-1聚合物时，可以把迸发光设置为525nm，发射光设置为590nm。
注意：此处测定萤光时毋须把迸发光和发射光设置在最大迸发波长和最大发射波长。
如使用萤光显微镜观察，测量JC-1单体时可以参考观察其它红色萤光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置。
检查JC-1聚合物可参考观察其它蓝色萤光，如碘化丙啶的设置。
出现红色萤光说明线粒体膜电位升高，而且该细胞很可能处于细胞自噬初期。出现白色萤光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。
B、流式细胞仪剖析
用流式细胞仪测量（Ex=488nm;Em=530nm）细胞自噬的情况。
红色萤光通过FITC通道一般为FL1来测量；蓝色萤光通过PI通道一般为FL2来测量。
正常细胞{FL-1亮,FL-2亮;R1}，自噬细胞{FL-1亮,FL-2暗;R2}，设门的位置根椐细胞种类、实验条件等不同而变化。
实验需设未经处理的正常细胞为阳性对照组和经CCCP处理的阴性对照组，根椐阳性和阴性对照组的双参数散点图来设定门的位置。
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