【摘要】：肺炎居疾病死亡首位,近些年来癌症的发病率在全球范围内仍呈持续上升的趋势,而这一趋势在中国尤其显著。明晰其发生、发展机制和开发出有效的根治方式对医学发展和人类健康越来越重要。本研究对临床肿瘤患者血清及腹腔囊肿中溶血磷脂酸(LPA)含量进行检查,明晰LPA在肿瘤患者中的抒发情况。以人肺肿瘤Calu-3细胞为研究对象,观察LPA对肺肿瘤Calu-3细胞的增殖、迁移及CFTR离子通道的影响细胞膜离子通道,并阐述了其作用机制,为癌症的医治提供实验数据和理论根据。本实验首先,采用ELISA(LPA)试剂盒测量肿瘤、肺炎及结核性腹膜炎患者血清及腹腔囊肿中LPA的含量,结果发觉:哮喘病人血清及腹腔囊肿中LPA含量较气胸和结核性腹膜炎患者血清及腹腔囊肿中LPA含量明显降低,差别具有统计学意义(P0.05)。采用CCK8实验测量LPA对Calu-3细胞增殖能力的影响,通过凹痕实验测量LPA对Calu-3细胞迁移能力的影响,流式细胞仪测量LPA对肺肿瘤Calu-3细胞周期的变化,实验结果显示:LPA才能促使Calu-3细胞的增殖和迁移,并降低细胞周期过程中S期的细胞数目。为进一步观察LPA对Calu-3细胞增殖和迁移的影响,我们采用萤光定量PCR技术观察了LPA对细胞增殖、迁移和自噬相关基因:VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc、D1、CDK2、p53的影响。
实验结果显示:随着LPA含量的降低,Calu-3细胞中VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc和D1、CDK2的mRNA抒发明显降低,而p53mRNA抒发水平明显升高。LPA通过与细胞表面的G蛋白偶联受体结合发挥其作用。G蛋白大致分为Gs、Gi和Gq家族,麻疹毒素(PTX)是Gi蛋白的特异性阻断剂,本研究在Calu-3细胞中加入PTX后发觉:VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc和D1、CDK2的mRNA抒发未见降低,p53mRNA抒发亦未见回升。据悉,我们还采用blot技术检查了Calu-3细胞中细胞增殖和转移相关蛋白VEGF、HIF-1ɑ、PCNA、c-myc、D1、CDK2、p53的变化。实验结果显示:LPA才能下调Calu-3细胞中VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc、D1和CDK2蛋白的抒发,上调p53蛋白抒发,从蛋白水平上进一步说明LPA才能促使Calu-3细胞的增殖和迁移。有研究报导,CFTR离子通道在抑制癌症细胞增殖方面有一定作用,我们通过免疫萤光和激光共聚焦显微镜实验观察到在肺囊肿Calu-3细胞膜上存在CFTR蛋白抒发细胞膜离子通道,因而采用全细胞膜片钳技术观察了不同含量LPA对Calu-3细胞膜CFTR离子通道电压的影响。
结果发觉:5、10、20μmol/L的LPA作用于Calu-3细胞后,CFTR离子通道电压较LPA未处理组具有不同程度的减少。以上结果表明,LPA才能降低Calu-3细胞的CFTR通道电压,这可能是LPA推动Calu-3细胞增殖的机制之一。为进一步研究LPA对Calu-3细胞膜上的CFTR离子通道的影响,我们采用细胞免疫萤光、blot的方式测量了LPA对细胞膜上CFTR蛋白抒发的影响,结果发觉:外源给予LPA才能增加细胞膜上CFTR蛋白的抒发,这与我们之前检查到的LPA减少Calu-3细胞膜上的CFTR通道电压结果相一致。本研究还发觉Gi蛋白阻断剂PTX才能抑制Calu-3细胞中LPA造成的CFTR电压降低,否认Gi蛋白参与了LPA作用于Calu-3细胞的过程。我们采用免疫萤光法、blot的方式测量了细胞膜上LPA受体LPA2的抒发,结果发觉:Calu-3细胞存在LPA2蛋白的抒发,而LPA2是Gi蛋白家族中最主要的膜蛋白之一,这就提示LPA通过作用于细胞膜上的LPA2受体发挥作用,进一步证明:LPA通过作用于细胞膜上的LPA2受体,从而推动肺肿瘤细胞Calu3增殖、迁移和侵袭。
本研究首先明晰了癌症病人血清及腹腔囊肿中LPA含量显著低于哮喘和结核性腹膜炎病人,说明LPA与癌症有着密切的关系。同时从体外实验证明LPA能促使肾病Calu-3细胞的增殖和迁移,降低细胞周期过程中S期的细胞数目。并证明了LPA才能降低促使细胞增殖和转移相关基因和蛋白的抒发,增加自噬相关基因的抒发。并且借助膜片钳技术与blot否认了LPA能减少Calu-3细胞的CFTR通道电压、降低细胞膜上CFTR蛋白的抒发。我们的研究结果提示LPA在肺肿瘤的发生及发展中发挥重要作用,为癌症的靶点医治提供了新的思路及理论根据