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[!--downpath--]大肠链球菌(),是相对简单的单细胞原核生物,所有DNA、RNA和蛋白质合成的机器都包含在同一细胞器中,可以相对容易的培养和操作。模式生物酵母菌酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖形式进行无性饲养的单细胞真核生物,分属于子囊菌纲(子囊酵母菌)、担子菌纲(担子酵母菌)、半知菌类(半知酵母菌)生物酵母菌实验视频,共由56个属和500多个种组成。假如说大肠弧菌是外源基因最成熟的原核生物抒发系统,则酵母菌是最成熟的真核生物抒发系统。模式生物酵母菌酿酒酵母(ae)是第一种起码在一万年前能够被人工培植的细菌,是最简单的真核生物,是由一个细胞组成的独立的生物个体,能在基本培养基上生长,便于培养和操作,被称为真核生物中的“大肠球菌”。早在1996年就完成了酿酒酵母的基因组测序,这是人类第一次获得真核生物基因组的完整碱基序列,被称为遗传学研究上的一座里程碑。模式生物酵母菌大肠球菌一般只有一条染色体,比高等生物的基因组要小得多,而且具有较高的基因密度(大概每1kb就有一个基因),没有内含子和极少有重复DNA,便于寻觅和剖析基因.模式生物酵母菌通过对酵母全基因组序列测定,其基因组大小约为12Mb,初步确定了5885个编码蛋白质的基因,基因、275个tRNA基因,第一次阐明了一种真核生物的全部基因的数量和大体上的功能分类.酵母基因组中有将近31%编码蛋白质或则具有开放阅读框,与喂奶植物编码蛋白质的基因有高度的同源性。
酵母菌基因组模式生物酵母菌酵母与其它真核生物相比,它们的基因组较小(约12Mb),基因数量也比较少(约5885).与大肠球菌类似,它们可以在实验室里快速饲养,在理想条件下,每次细胞分裂大概90min,可以从单个细胞饲养成克隆群体.酵母作为模式实验系统最重要的优点是,酵母细胞除了简单,但是具有所有真核生物细胞的主要特点,如富含一个独立的细胞核、多条线性染色体包装成染色质、细胞质包含了全部的细胞器(如线粒体)和具有细胞骨架结构(如肌动纤维蛋白)等.模式生物酵母菌大肠弧菌的生活周期很短,而且单个细胞可以很容易的获得一个遗传上同源的细胞群体(克隆).真菌是单倍体,这意味着即便是隐性突变,也才能表现出突变的表型,同时真菌之间可以便捷地进行遗传物质的交换,真菌的这种特点以便对其进行遗传学研究.模式生物酵母菌大肠球菌作为生命科学研究的模式系统,其主要优势是具有遗传交换系统.遗传交换使定位突变、构建含多种突变的菌种、构建拿来分辨显性突变和隐性突变及进行顺反式剖析的部份双倍体的菌种成为可能.这些遗传交换系统主要通过两种方法建立的.模式生物酵母菌10第一种方法是大肠球菌通过性结合交换DNA,大肠弧菌的育性质粒(F因子,F-)具备把自身从一个细胞转移到另一个细胞的能力.因子介导的结合是一个复制的过程,F+细胞转移一个拷贝的F因子给F-细胞.有时,F因子整合到染色体中,都会导致宿主染色体通过接合向F-细胞转移.富含整合的F因子的菌种称作Hfr弧菌(高频重组弧菌,),这些材料对于进行遗传交换研究特别有用。
模式生物酵母菌11第二种方法是通过噬菌体介导的转导,噬菌体成熟时有一部份噬菌体的DNA被宿主DNA所替代,当噬菌体感染下一个细胞时,从原先宿主哪里获得的染色体DNA片断可以和被感染的宿主染色体发生重组,造成遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞。模式生物酵母菌12在酵母系统中,单倍体和双倍体细胞的存在推动了酵母的遗传剖析.酵母在单倍体和二倍体的状态下均能生长,并能在实验条件下较为便捷地控制单倍体和二倍体之间的互相转换,这些转换是通过交配(单倍体到双倍体)和孢子生成(双倍体到单倍体)来实现的,这对其基因功能的研究非常有利.比如,要想晓得一个特定的基因是否是细胞生长所必需的,可以在单倍体里敲除这个基因,单倍体细胞只能承受非必需基因的敲除。酵母菌遗传学研究应用模式生物酵母菌13酵母中容易对其基因组做精确的人为突变,当把末端与基因组的任何一个特定区域同源的线性DNA引入到酵母细胞中,酵母基因组还会发生特别高的同源重组,造成目标染色体序列被所用的目的染色体片断所替代.如精确地删掉整个基因的编码区、改变单个特定的密码子,甚至改变启动子中一个特定的核苷酸对,这促使研究基因或其调控序列的功能等具体问题显得比较容易.模式生物酵母菌14在20世纪60年代末,和Nurse便认识到用遗传学方式研究细胞周期的可能性.采用酿酒酵母细胞构建系统模型,经过一系列试验,分离出细胞周期基因发生突变的酵母细胞,陆续发觉了一系列与细胞周期调控相关的CDC基因()。
模式生物酵母菌15一种被称为“START”的基因对控制各个细胞周期的最初阶段具有决定性的作用.Nurse在的基础上,发觉了调节细胞周期的一种关键物质CDK(细胞周期蛋白依赖激酶),并证明CDK是通过对其它蛋白质的物理作用(乙酸化作用)驱动细胞周期.鉴于借助酵母分子遗传学对细胞周期调控理论的巨大贡献,Hunt、和Nurse入选了21世纪的首届诺贝尔生理医学奖.模式生物酵母菌16细胞生命活动中的许多过程比如酶催化代谢反应、信号转导、蛋白质的修饰与加工、蛋白质的转运等都表现为一种蛋白质与另一种蛋白质间的互相作用.传统的免疫印迹、等方式很难满足对蛋白质分子之间互相作用这一动态过程的研究须要.借助酵母转录因子的特性,于1989年成立了一种十分简便而有效的研究蛋白质互相作用的方式———酵母双杂交系统。模式生物酵母菌17酵母双杂交系统最突出的特征是可以在酵母这些生长迅速且易操作的体系中研究真核细胞的蛋白质-蛋白质互相作用,并且还可通过cDNA文库筛选直接找到与未知蛋白质互相作用的蛋白质的基因。模式生物酵母菌18近些年来为了适应更广泛的用途,在原有酵母双杂交系统基础上发展了大量的衍生系统,如蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统、小官能团三杂交系统、RNA三杂交系统等类型.据悉,还出现了为研究膜蛋白的互相作用而改进的SOS富集系统(,SRS),在该系统中,蛋白质之间的互相作用被人为限制在酵母细胞膜上。
模式生物酵母菌19应用模式生物酵母菌年,法国公司首先使用重组大肠球菌生产人胰岛素,成为世界上第一个上市的基因工程抗生素。由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血压作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别,并且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点,充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。模式生物酵母菌21大肠球菌抒发外源基因的优势模式生物酵母菌22大肠球菌作为抒发外源基因受体菌的特点大肠球菌抒发外源基因的劣势模式生物酵母菌23蓝黑斑筛选模式生物酵母菌24筛选原理野生型大肠球菌形成的β-半乳香豆素酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吡啶-β-D-半乳香豆素)切割成半乳糖和深灰色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落形成颜色变化,而颜色变化是鉴别和筛选的最直观有效的方式。模式生物酵母菌25工程菌及载体基因工程菌为β-半乳香豆素酶缺陷型弧菌。这些寄主菌的染色体基因组中编码β-半乳香豆素酶的基因突变,导致其编码的β-半乳香豆素酶丧失正常N段一个146个多肽的短肽(即α肽链),因而不具有生物活性,即难以作用于X-gal形成红色物质。
用于蓝黑斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因,lacz'中包括:一段β-半乳香豆素酶的启动子;编码α肽链的区段;一个多克隆位点(MCS)。模式生物酵母菌26α-互补缺陷株基因未能单独编码有活性的β-半乳香豆素酶,但当菌体中富含带lacz'的引物后,引物lacz'基因编码的α肽链和弧菌基因组抒发的N端缺陷的β-半乳香豆素酶突变体互补,具有与完整β-半乳香豆素酶相同的作用X-gal生成黑色物质的能力,这些现象即α-互补。模式生物酵母菌27操作中,添加IPTG(异氰基吲哚-β-D-半乳香豆素)以激活lacz'中的β-半乳香豆素酶的启动子,在富含X-gal的固体平板培养基中菌落呈现黄色。以上是携带空载体的菌种形成的表型。当外源DNA(即目的片断)与含lacz'的载体联接时,会插入进MCS,使α肽链读码框破坏,这些重组引物不再抒发α肽链,将它导出宿主缺陷弧菌则无α互补作用,不形成活性β-半乳香豆素酶,即不可分解培养基中的X-gal形成白色,培养表型即呈现蓝色菌落。模式生物酵母菌28实验中,一般蓝白筛选是与抗性筛选一齐使用的。含X-gal的平板培养基中同时富含一种或多种载体所携带抗性相对应的药物,这样,一次筛选可以判别出:未转化的菌不具有抗性,不生长;转化了空载体,即未重组引物的菌,长成白色菌落;转化了重组引物的菌,即目的重组菌,长成黑色菌落。
模式生物酵母菌29酵母基因工程由甲型脑炎病毒(HBV)感染造成的急慢性甲型脑炎是一种严重的传染病,每年约有200万患者死亡,并有3亿人成为HBV携带者,其中相当一部份人可能转化为肝硬化或肿瘤病人。目前对甲型脑炎病毒还没有一种有效的根治抗生素,为此高含量甲型卡介苗的生产对防治病毒感染具有重大的社会效益,而借助重组酵母大规模生产甲型卡介苗为其广泛应用提供了可靠的保证。模式生物酵母菌30产肝炎表面抗体的重组巴斯德毕赤酵母产肝炎表面抗体的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的建立整合型重组巴斯德毕赤酵母的建立PARS2PARS2BglIIBglIIHBsAgPHIS4PHIS4IIBglII11kb11kbBglIIBglIIHBsAgPHIS4PHIS4重组分子重组分子转化his染色体DNA染色体DNA模式生物酵母菌31重组菌首先在富含甘油的培养基中培养,待甘油用尽后,加入乙醇诱导肝炎病毒的表面抗体氨基酸(HBsAg)抒发,最终S蛋白的产值可达细胞可溶蛋白总数的3%在大规模的生产过程中,巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养,最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒,足够制成900万份肝炎卡介苗模式生物酵母菌32酵母菌作为抒发外源基因受体菌的特酵母菌抒发外源基因的优势酵母菌抒发外源基因的优势全基因组测序,基因抒发调控机理比较清楚,遗传操作简便全基因组测序,基因抒发调控机理比较清楚,遗传操作简便能将外源基因抒发产物分泌至培养基中能将外源基因抒发产物分泌至培养基中具有原核病菌难以比拟的真核蛋白翻译后加工系统具有原核病菌难以比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不富含特异性的病毒、不产内毒素,日本FDA认定为安全的不富含特异性的病毒、不产内毒素生物酵母菌实验视频,日本FDA认定为安全的基因工程受体系统()基因工程受体系统()酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物模式生物酵母菌33应用前景