一文盘点常见ADC脱靶毒性有什么？其发生机制怎样？有什么影响诱因？通过什么优化举措可以加以改善？
抗原抗生素偶联物(ADC)是近些年来癌症领域极具前景的一种新型根治方法，ADC平台的概念是通过将细胞毒性抗生素选择性地递送至癌症细胞，但是限制曝露于健康的正常细胞，进而降低细胞毒性抗生素的医治指数。虽然ADC相比传统放疗的靶点性大大提高，而且也不可防止报告正常细胞/组织中的剂量限制性毒性(DLT)。目前，DLT一直是ADC开发的关键挑战。ADC在正常细胞/组织中的毒性机制尚不清楚，但觉得大多数DLT与靶向无关。不仅联接子-抗生素不稳定性引起循环中细胞毒性抗生素（有效荷载）过早释放外，受体依赖性（FcγR、FcRn和C型凝集素受体）和受体非依赖性（非特异性内吞）机制摄入/转运ADC可能造成正常细胞的脱靶毒性。发表在《Ther》上的一篇综述[1]，回顾了正常细胞中ADC非靶向依赖性摄入和毒性的潜在机制，并讨论了可能影响这种机制的潜在诱因。相关内容能为愈发深入地了解ADC脱靶毒性的潜在机制提供根据，有助于开发规避这种机制的方式，从而改善下一代ADC的总体医治指数。现将该综述中有关联接子-抗生素不稳定性、非特异性内吞作用的相关内容梳理如下，以飨读者。
ADC抗生素非靶向依赖性摄入和毒性的机制
虽然ADC毒性被觉得主要来始于有效荷载，但非靶点正常细胞摄入ADC，并释放出有效荷载因而形成毒性的相死机制尚不清楚。这些摄入可通过多种机制发生，目前正在进行相关研究来了解这种机制并优化ADC的三种关键组分（即单克隆抗原、连接子和有效荷载）。按照大多数恐怕值，ADC在人体靶（病变）部位仅发生适度的积聚（每克病变约0.1%的给药剂量）。为此，ADC的主要部份保留在循环中或分布到正常组织中，可能被摄入和分解代谢，造成正常细胞毒性。靶向依赖性和非依赖性摄入机制均可能导致正常细胞的ADC摄入和毒性。本综述将重点关注正常细胞对ADC非靶向依赖性摄入（亦称为非特异性摄入）及其可能造成的脱靶毒性的机制等相关内容。
表1.ADC中使用的不同类别有效荷载的详尽信息和临床研究中一般报告的主要毒性
联接子-抗生素不稳定性
联接子-抗生素不稳定性可造成有效荷载过早释放到血液中，并造成ADC的脱靶毒性。联接子的选择是ADC稳定性背后的主要驱动诱因之一。第一代ADC抗生素采用酸可裂解联接子（比如，腙），其被设计为在血清中性pH环境中稳定，但ADC内化后能在溶酶体内较低pH条件下释放。
但是，这种初期ADC常常遭到血清稳定性差的困惑，进而造成循环中有效荷载的开裂（图1）。造成ADC血清不稳定性的诱因包括对血浆蛋白酶的敏感性，尤其是基于肽的联接子和自发去偶联，如逆转录酶-马来酰吡啶转移到血清蛋白上存在的游离胺类上。除安全性问题外，不稳定ADC的效果也可能增加，由于抵达病变的ADC不再完整偶联有效荷载。在个别情况下，引入不可裂解联接子可减轻联接子裂解问题。比较具有可裂解联接子（SPP-DM1和mc-VC-PAB-MMAE）和不可裂解联接子（mcc-DM1和mc-MMAF）类型ADC的结果显示，对于特定靶标(CD22)，具有不可裂解联接子的ADC的毒性（肾脏和血液学毒性）减少。同样，与富含可裂解二硫键的美登素类ADC相比，含不可裂解硫醇MCC联接子的ADC，其临床前安全性特点得到改善。采用不可裂解联接子ADC的毒性减少被觉得是因为步入体循环的游离细胞毒性有效荷载释放降低。但是，并非所有靶抗体均适用于含不可裂解联接子的ADC的医治，由于须要将完整的mAb分解代谢能够释放联接抗生素以发挥抗病变作用。
图1.正常细胞摄入ADC或游离有效荷载的潜在机制。靶抗体可能在正常细胞上抒发，并有助于ADC的靶向依赖性摄入。据悉，结合IgG抗原Fc保守区的其他受体，如Fcγ受体(FcγR)、新生儿Fc受体(FcRn)和C型凝集素受体(CLR)也可能有助于正常细胞中ADC的非靶向依赖性内化/转运。非特异性内吞机制，如巨胞饮或小胞饮也可能造成完整ADC或游离有效荷载内化（因为联接子-抗生素不稳定或胞外蛋白酶活性在细胞外释放）。游离有效荷载也可能通过其他机制步入正常细胞，如被动扩散（假如具有膜渗透性）、非特异性内吞或特异性转运蛋白（假如膜转运蛋白的底物）介导的摄入。据悉，抗体阴性靶细胞还能否通过将有效荷载释放到局部环境中介导毒性，随即被抗体阳性正常细胞（旁观者效应）通过被动扩散、转运蛋白介导的摄入或通过其他非特异性内吞机制摄入。
含可裂解联接子的ADC也可能通过旁观者效应降低效果，是针对拷贝数较低、肿瘤抒发异质性或内化率较低的癌症细胞靶抗体的首选。为此，联接子-抗生素稳定性一直是未来ADC研制优化的关键领域，致力最大限度地增强获得成功的ADC的机率。对于作用强效和具有膜渗透性的细胞毒素，如吡啶苯二氮卓类(PBD)，关注含这种有效荷载的ADC的稳定性尤其重要。据悉，不仅联接子的可裂解性，释放有效荷载的膜渗透性同样可能影响正常细胞中潜在的脱靶细胞毒性，因而影响ADC的医治指数。
结合位点也可能调节ADC的稳定性和药代动力学。使用表面曝露的多肽（如赖谷氨酸或半胱谷氨酸）的传统非特异性偶联方式会形成高度异质性的ADC（抗生素-抗原比[DAR]，0-8），进而造成ADC的集聚机会降低，但是其整体血清稳定性也会增加。因而，这种采用非特异性结合位点的ADC也可能造成正常细胞中非靶向依赖性摄入和毒性降低的安全性挑战。近些年来，先进的联接子技术和对结合位点认识的提升形成了更多的均一性高的ADC，同时改善了总体联接子-抗生素的稳定性并降低了血清中细胞毒性有效荷载的过早开裂。那些具有更高联接子-抗生素稳定性的ADC也可以发生更多由靶向驱动的有效荷载释放，进而提升效果。为此，各类偶联位点工程策略，包括使用特定多肽（天然或工程）、Fc聚糖和短肽标签的几种特异性位点偶联，已被用于生成具有改善安全性特点的DAR均质性ADC。
比如，采用首个特异性位点偶联技术--（未配对半胱谷氨酸介导的偶联）偶联技术的ADC，其在临床前的耐受性相对优于具有相同有效荷载和非特异性偶联技术的传统ADC。据悉，在临床前研究中，由半胱谷氨酸工程抗原和PBD（使用新型起火二硫键联接子）组成的ADC显示出改善的安全性特点（减少毒性），且效果相当，表明其可潜在降低ADC的医治指数。
1.1与联接子-抗生素不稳定性相关的ADC毒性
中性粒细胞降低症（中性粒细胞计数减少）是ADC的一种重要的非靶向依赖性DLT，因为血清中可裂解联接子不稳定，造成膜渗透性游离有效荷载提早释放。中性粒细胞降低是许多通过蛋白酶可裂解的缬氨酸-瓜谷氨酸（VC）联接子与MMAE结合而成的ADC的常见毒性，如、ASG-5ME、、、和PSMAADC。Zhao等人[2]近来进行的一项体外机制研究表明，基于VC-MMAE的ADC诱导的中性粒细胞降低症是因为释放的有效荷载对骨髓中分化的中性粒细胞的直接细胞毒性作用所致。按照联接子物理，VC联接子预期在溶酶体中发生细胞内半胱谷氨酸蛋白酶介导的裂解。Zhao等人[2]的研究结果阐明，在骨髓微环境中局部分化的中性粒细胞分泌的谷氨酸蛋白酶有助于VC联接子在细胞外的切割，并释放膜渗透性MMAE造成对骨髓中分化的中性粒细胞的细胞毒性。但是，这项研究的结果提出了另一个问题，即为何在骨髓细胞外释放的膜渗透性MMAE有效荷载仅对分化的中性粒细胞（髓系细胞）有毒性，而对骨髓中的其他多种敏感细胞类型如造血干/祖细胞、红系和巨核细胞系细胞没有毒性，因此这须要进一步研究论证，非常是使用体内模型比较基于可裂解和不可裂解联接子-MMAE的ADC的血液毒性（非常是分化骨髓细胞的毒性），以明晰了解和否认细胞外氨酸蛋白酶在中性粒细胞降低症中的作用。
同样，周围神经肿瘤（PN，周围神经损伤的结果）是另一种与微管抑制剂ADC（不考虑靶抗体）相关、导致医治终止和/或剂量增加的重要非靶向依赖性临床毒性。PN被觉得是由联接子-抗生素不稳定性驱动，因而造成体循环中膜渗透性游离有效荷载（微管抑制剂）过早释放所造成的毒性。微管抑制剂可破坏间期微管功能，这对于将关键必需蛋白从神经元胞体主动转运至远端突触至关重要，最终造成周围神经腺瘤。
PN的特点为全身僵硬和疼痛，最终可能加重并造成极其肿胀和无力，一般在含膜渗透性MMAE有效荷载的ADC重复给药后观察到（与蛋白酶可裂解联接子联接，比如VC联接子），但不表现在含膜不可渗透有效荷载MMAF的ADC中。据悉，PN是几乎所有含膜渗透性美登素（DM1和DM4）有效荷载与可裂解联接子结合的ADC的常见不良风波。
不仅在体循环中被动扩散游离膜渗透性有效荷载外，ADC通过受体依赖性或非依赖性机制的分布/摄入也可能发生在周围神经中。为此，须要进行额外的体内调查研究，以明晰了解周围神经的有效荷载/ADC曝露机制。值得注意的是，在临床前植物模型中并不总能预测临床中观察到的PN。比如，对基于VC-MMAE的ADC进行的标准临床前药理学研究未能预测在临床中观察到的PN。但是，对于其他含微管抑制剂（如DM1或DM4）的非MMAEADC，若在临床前种属中观察到PN，这些不良反应在临床表现中的可预测性良好。
1.2旁观者效应
不仅靶抗体阴性细胞摄入ADC后的直接细胞毒性外，ADC的游离有效荷载也可能通过旁观者效应对毗邻的靶抗体阳性细胞形成细胞毒性。在抒发抗体的靶细胞（靶抗体阴性）中，ADC经内化步入病变细胞后细胞膜透性，随即在溶酶体中被分解代谢，并在细胞质中释放出游离有效荷载。之后游离有效荷载既可以被动扩散步入细胞外间隙（膜渗透性、高亲脂性有效荷载），也可以因为细胞膜完整性的失去而被释放（靶细胞死亡后）。释放的游离有效荷载可能通过被动扩散、转运蛋白介导的摄入或通过其他非特异性内吞机制步入靶抗体阳性的正常细胞，进而导致细胞毒性。
ADC的旁观者效应一般与癌症杀伤（效果）降低相关，尤其是针对抗原抒发异质性的病变。使用体外菌落圆球试验和共培养系统以及体内异种移植模型证明了旁观者效应对于ADC效力和有效性的影响。但是，达到旁观者效应所需的细胞膜渗透性降低也可能造成脱靶毒性。因此与采用不可裂解联接子、不可渗透有效荷载的ADC相比，释放的膜渗透性有效荷载可能溶入正常组织，并引起毒性降低。诸如，(Can-M)和(Can-R)是靶点CanAg（癌症相关碳水化合物抗体，MUC1的一种新型糖型）的两种ADC，但分别具有相对不稳定的SPP[N-琥珀酰吡啶基4-（2-氯苯基二甲基）戊醇类]联接子/DM1和稳定的SPDB（N-琥珀酰吡啶基-4-（2-氯苯基二甲基）丁香豆素）联接子/DM4的联接子/有效荷载组合。但是，仅在接受Can-M医治的实体瘤肝转移病人中，观察到肝毒性（尿酸下降），表明是因为ADC对毗邻正常肝细胞的旁观者效应所致[3]。ADC技术的最新进展带来了细胞毒性有效荷载的发展，其可在癌症细胞中代谢为膜不可渗透性代谢物（比如，）(，2016)。这些方式可能控制旁观者效应带来的不良影响--既保留杀害癌症细胞的有益物理性质，同时也明显减少针对正常细胞的四肢毒性。
非特异性内吞作用
内吞作用是细胞摄入营养物质、调节跨膜动力学和突触囊泡再循环等的基本过程。内吞作用也可在大分子（包括IgG/ADC）摄入和分布至正常细胞中发挥重要作用。内吞作用大致分为吞噬作用（颗粒内化）和胞饮作用（可溶分子内化，亦称为固相内吞作用）。据悉，依照内吞囊泡产生的大小，内吞作用已被分为大尺度和微尺度内吞过程。但是，在不同的已发表参考文献中使用的内吞机制的不同命名中观察到部份重叠概念并不稀少。可能造成IgG/ADC非特异性摄入的主要内吞机制的关键特点列于下表。
表2.主要内吞机制的关键特点
大尺度内吞作用包括吞噬作用和巨胞饮作用，分别涉及大颗粒或大容积部份的内化。吞噬作用涉及将大规模颗粒摄入到包围颗粒的细胞膜变型（肌动蛋白的局部重排）中。富含ADC或ADC集聚体的免疫复合物也可能被该过程摄入。与吞噬作用相像，巨胞饮也是一种肌动蛋白依赖性过程，它涉及在相对大量的细胞外液（而不是颗粒）区域周围产生质膜的褶皱延展，以介导内吞作用。微尺度的内吞过程涉及使用大小大于200nm的微粒体吞噬较小容积物质。这种过程常常须要像网格蛋白或小窝蛋白这样的特殊壳体蛋白（图2）。介导的内吞作用(CME)是大多数细胞类型中受体介导的微尺度内吞作用的主要方式，也是ADC靶点内化步入靶抗体/受体抒发细胞的主要机制。络合物与特定膜受体的结合启动了讯号风波的级联反应，造成募集特定的接头蛋白进行网格蛋白包被的囊泡产生（图2），这种新产生的囊泡被动力蛋白（GTP酶）切断，并释放用于进一步的细胞内转运。小窝蛋白介导的内吞作用涉及膜包被蛋白小窝蛋白产生的烧杯状结构（小窝），它也依赖于动力蛋白进行囊泡分裂。小窝蛋白介导的摄入在许多细胞类型中起主要转运作用，尤其是在内皮细胞中占优势。重要的是要认识到，除网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用外，还存在其他几种微吞过程，包括CLIC/GEEC、ARF6、和四跨膜蛋白相关过程。
图2.宏观和微观内吞过程的关键结构特点示意图。吞噬作用涉及FcγR结合Cdc42（细胞分裂周期蛋白42）和Rac1（Ras相关C3保妥适毒素底物）的局部激活引起肌动蛋白聚合。巨胞饮过程涉及大量液体的摄入，形态学特点为褶皱的巨胞饮小体。小窝内吞作用的特点是通过电子显微镜(EM)可见与固醇相关的小窝的尖峰样包被。最明晰的微尺度内吞过程包括网格蛋白介导的内吞作用，它涉及产生由网格蛋白三聚体组成的复杂晶格，产生刚毛外型的内体，可通过EM进行形态学鉴别。
无论涉及何种机制，内吞物质就会在细胞内得到加工，包括通过内溶酶体途径的运输。标记降解的物质从初期内体进展到晚期内体，之后步入其在溶酶体中的最终目的地。另外，内吞的物质可以通过回收内吞体重新回到细胞表面。其他运输结果是转胞作用到型腔空间或分选到不同的亚细胞区室，如高尔基复合体和叶绿体。细胞内转运率也可能因内吞机制而异。诸如，已否认网格蛋白介导的内吞作用存在从初期内体返回细胞表面的快速再循环途径。同样，通过巨胞饮和吞噬作用内化的内容物也可能被回收，但更典型的是被加工用于溶酶体降解。有趣的是，在内皮细胞中，通过小窝介导的内吞作用内化的官能团优先分选到亚细胞区室中，以防止溶酶体降解途径。
总体而言，上述宏观和微观内吞过程均可能有助于ADC被摄入步入正常细胞。关于正常细胞对ADC的非靶向依赖性摄入相关毒性，小窝依赖性内吞、巨胞饮和吞噬作用等非特异性内吞机制是潜在的重要机制。很显著，不同正常组织和细胞类型的内吞机制和内吞总体速度也不同。许多特殊的免疫细胞（包括巨噬细胞和树突状细胞）特异性地将此作为主要功能，而且具有更高的内吞率。例如，已知细胞（肾脏中的固有巨噬细胞）在免疫结合物（包括ADC）的非特异性摄入和消除中发挥着重要作用。内皮细胞因为其在血管与间质室界面的战略定位细胞膜透性，大分子的内吞率也相对较高。但是，目前仍未发表关于什么正常细胞类型和组织在细胞内活性最强的完整描述。为此，了解不同正常细胞/组织中的内吞速度对于理解非特异性内吞作为ADC摄入和毒性的潜在机制的作用具有重要价值。
2.1影响IgG/ADC非特异性内吞作用的诱因
大分子的理化性质可能影响其在正常细胞/组织中被内吞的可能性。IgG/ADC表面的分子电荷是共同影响抗原组织分布和PK的许多参数中的一个重要参数。带正电荷的分子被大多数喂奶植物细胞膜以及细胞外基质（硝酸肝素蛋白聚糖）中带负电荷的官能团吸引，这些近距离的集聚降低了局部含量，进而造成正常组织/细胞中更多的非特异性内吞摄入。既往调查性研究表明，IgG抗原净正电荷的降低造成血清消除率降低，组织分布降低，而净正电荷的降低会造成组织分布减轻。重要的是，等电点(pI)变化起码1个单位或以上足以形成可检测的组织分布和PK变化。这种推论也可能适用于ADC，支持ADC电荷可能影响正常细胞非特异性内吞作用的假定。为此，在未来的ADC设计方面，通过降低正电荷或平衡整体表面电荷分布来进行电荷修饰是一种值得考虑的方式。但须要注意的是，与正常组织相像，电荷修饰也可能影响癌症细胞效果相关的靶抗体依赖性ADC摄入。优化ADC表面电荷以降低正常细胞的非靶向依赖性摄入，同时保留癌症细胞的靶向介导摄入，可有利改善ADC的医治指数。
ADC的疏水性也可能在其被正常细胞非特异性摄入中发挥作用。ADC中使用的许多抗生素-联接子组合具有疏水性，尤其是对于具有高DAR的ADC。高DARADC疏水性的降低主要通过细胞和肝窦内皮细胞推动ADC集聚和加速非特异性清理。与肝细胞相像，具有高DAR的ADC可能被其他具有较高非特异性内吞能力的正常细胞迅速消除，造成非靶向依赖性（脱靶）毒性。譬如，对于基于MMAE的ADC，在体内大鼠模型中，DAR=4纯化ADC的耐受性是DAR=8的ADC的2倍[4]。该推论一般也适用于其他ADC，因而DAR优化是改善ADC医治指数的关键设计参数。偶联和联接子技术的最新进展可能克服高DARADC的那些何必要的PK问题。诸如，拟通过改建抗生素联接子的疏水性或使用聚乙二醇(PEG)掩藏其固有的疏水性来增加ADC整体的疏水性，进而减少较高DAR组分的非特异性消除率，以改善ADC的PK特点和医治指数。
2.2与非特异性内吞作用相关的ADC毒性
非特异性内吞作用（尤其是巨胞饮）被觉得是正常结膜上皮细胞和巨核细胞摄入ADC的途径，分别造成眼毒性和血小板降低症。巨噬细胞介导的结膜上皮细胞摄入的证据主要是因为人原代结膜上皮细胞(体外)对AGS-16C3F(靶点ENPP3抗体，含mc-MMAF联接子-有效荷载的ADC)的细胞毒性减少，其正电荷和/或疏水性增加，而且与EIPA[5-(n-烷基-n-异氰基)-(巨噬细胞抑制剂)]共同抑制ADC摄入[5]。在这项研究中，作者通过3种不同的机制改变了ADC电荷或疏水性，包括添加聚丙氨酸肽的联接子、某些带电多肽的突变改变以及PEG络合物与抗原的联接。在结膜上皮细胞中的这种实验结果与电荷修饰（降低净正电荷）改变正常细胞中ADC摄入和毒性的假定基本一致。在形成的9种突变抗原ADC（带负电荷的多肽数目降低）中，3种在体外人结膜上皮细胞中显示医治指数改善[5]。
作者进一步报导了电荷修饰工程化ADC（正电荷减低）在其他一些正常细胞类型（HUVEC和成纤维细胞）中的摄入和毒性较低；但是，在巨核细胞中没有观察到一致的改善，以前报导巨核细胞对相同的非特异性摄入机制敏感[2]。据悉，很难将本研究中正常结膜上皮细胞的体外结果与实际体内改善相关联，由于使用的兔模型中的面部结果显示，在结膜上皮细胞中没有任何肿瘤/缺陷（细胞毒性），正如其他ADC在临床或其他植物模型中所报告的。
本研究结果总体上为电荷在人结膜上皮细胞非靶向依赖性摄入中的重要性提供有力证据，但关于摄入机制主要是巨胞饮的推论仍有待确定。ADC电荷修饰也可能影响结膜上皮细胞中其他潜在受体(FcγRs、CLRs)介导的摄入机制，本研究未完全排除这种机制。
同样，调节巨胞饮介导的内化可增加ADC(AGS-16C3F)对巨核细胞的毒性（血小板降低症）。但是，文献中关于巨胞饮作为分化巨核细胞对于ADC的靶向依赖性摄入机制存在一些不一致。通过电子显微镜(EM)评价可最终确定巨胞饮，通过观察到“皱褶”巨胞饮小体形态。EM评价结合标记的ADC有助于进一步否认正常细胞中巨胞饮介导的ADC摄入和亚细胞定位的参与。
未完待续，有关受体介导的摄入机制等相关内容，详情详见深入阐述正常细胞中ADC非靶向依赖性摄入和相关毒性的潜在机制（上篇）。
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