细胞膜颜料+外泌体颜料双染策略，彻底解决外泌体摄入实验中的假阴性问题。
外泌体的细胞摄入实验中有两个无法回避的问题：
1）集聚导致的假阴性：常规亲脂性颜料在水氨水中自发产生颜料集聚体或结节，无法吹散，集聚颜料的萤光讯号极易与外泌体混淆，导致观测结果的假阴性；
2）二次标记导致的假阴性：因为外泌体膜与细胞膜结构的相像性，常规颜料标记的外泌体在被细胞摄入后一旦开裂细胞膜选择性通透，会二次标记细胞膜带来非外泌体萤光讯号。
那有哪些染色方式可以完美解决上述的两个困局呢？
：99%标记率，不二次标记的膜特异性颜料
基于Tech.技术开发的具有极高的特异性和低于99%的标记率，且一旦从外泌体表面开裂，其活性羧基即刻变性失活，掉落的仅发出难以被测量的微弱萤光，不再对膜结构二次标记，防止颜料二次标记带来的假阴性。Fig.1分别为对外泌体的标记率及物理模拟活性羧基变性后对外泌体的标记率：
Fig.1（a）505对外泌体的标记率与（b）物理模拟开裂的的505结构对外泌体的标记率
不集聚、不弥散的“真实”染色
通过共价偶联外泌体膜而实现标记发光，防止了两大“假阴性”：
1）非亲脂性颜料细胞膜选择性通透，无集聚趋势，防止了因颜料集聚带来的假阴性；
2）不弥散，仅标记外泌体膜轮廓，不标记细胞膜，防止了颜料弥散二次着色细胞膜带来的假阴性。Fig.2为弥散性亲脂颜料DIO标记的外泌体与非弥散性505标记的外泌体被U251细胞摄入结果对比，可以见到显著的DIO弥散标记细胞膜的痕迹。
Fig.2弥散性亲脂颜料DIO标记的外泌体（a）与非弥散性505标记的外泌体（b）被U251细胞摄入
保留外泌体结构
被广泛应用于各类动动物细胞来源的外泌体的体内外示踪剂，对外泌体的形态学及其生物学功能的影响微乎其微。我们对标记后的外泌体进行TEM、和blot表征（Fig.3），发觉：
1）标记后的外泌体在透射电镜下依然保持标志性的外泌体茶托状结构；
2）标记后外泌体平均粒径分布差别不显著，仅降低~5nm，这是大量均匀的负载在外泌体表面的结果；
3）blot显示标记前后蛋白的条带位置不变，说明不会标记外泌体表面蛋白。
Fig.3被（a）标记后和（b）标记前的外泌体的TEM图象；被（c）标记后和（d）标记前外泌体的粒径剖析（）;（e）标记前后的外泌体blot：左为标记前的外泌体，右为经标记后的外泌体。
+双染策略
基于Tech.技术开发的系列颜料具有同样的膜标记特征，可以清晰的诠释细胞膜轮廓，与结合可以完美实现外泌体被细胞摄入实验。Fig.4为505标记的外泌体+标记细胞膜和PKH-67标记的外泌体+F-actin摄入实验对比，图Fig.4a中可以见到555标记的清晰的绿色膜轮廓，经过505标记后的红色外泌体分散在细胞膜内；Yu等使用F-actin标记细胞膜轮廓，PKH-67标记外泌体，虽然共聚焦显微镜下观测到的外泌体明亮的红色萤光，但是该红色萤光呈弥散状分布，无法较好分辨外泌体与细胞膜。
Fig.4（a）505标记的外泌体+标记细胞膜和（b）PKH-67标记的外泌体+F-actin标记细胞膜摄入实验对比
悉心的朋友可能注意到了，为何merge中有红色光点呢？这要从实验操作中找寻红色光点的身分。有了+极佳的颜料组合，只需两步即可完成外泌体摄入实验：1）首先用标记外泌体，除去游离颜料后，与细胞共培养，此时细胞吞噬标记的外泌体；2）使用标记细胞膜，PBS驱走游离颜料后，共聚焦显微镜下观测即可。
Fig.5中，黑色表示细胞膜，红色表示外泌体，白色颗粒状表示被+双染的区域，也就是未完全步入细胞膜的外泌体。
Fig.5（a）555（U251细胞膜）+505（果汁外泌体）双染外泌体摄入实验（b）555（A549细胞膜）+505（果汁外泌体）双染外泌体摄入实验
因为无细胞膜选择性（会标记外泌体）且完全不透过细胞膜，+双染策略不仅仅可以看见被细胞摄入的外泌体（红色），能够清晰区分出没有完全步入细胞膜的外泌体（蓝色）。
基于Tech.开发的和因为上述特点，+双染技术，可以帮助科学家完美解决外泌体摄入实验中的假阴性问题。
