谭慧杰, 杭宝建, 石峰, 李俊
山东省食品药品检验研究院
概括
目的：为生物类似药的研究开发提供借鉴和参考。
方法:通过查阅大量国内外文献,结合生物类似药的相关法规,梳理生物类似药的理化性质、生物活性、纯度与杂质、免疫学性质等药剂学性质,并对相关的分析方法进行总结分析。
结果与结论：生物仿制药的开发需要采用先进、灵敏的技术和方法表征生物仿制药的质量属性，评价生物仿制药与参比药的相似性。本文对生物仿制药药剂学性质分析方法的相关研究进行综述，为生物仿制药的开发和质量控制提供参考。
文本
生物类似药是指在质量、安全性、疗效等方面与已注册的参照药品相似的生物制品[1]。生物类似药主要包括单克隆抗体、重组细胞因子蛋白、重组激素等。随着早期上市生物技术药物相关专利到期，以及有利于提高药品可及性、降低药价、满足更多患者临床用药需求的生物类似药的出现，我国已将生物制药定位为国家战略性新兴产业。在政策、研发、资本、临床需求等刺激下，我国掀起了生物类似药发展的浪潮。
为规范生物类似药研发与评价工作，促进我国生物类似药市场发展，2015年，原国家食品药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布《生物类似药研发与评价技术指导原则（试行）》[1]，明确了生物类似药的定义，提出了生物类似药研发与评价的基本原则，对生物类似药的药学、非临床和临床研究与评价提出了具体要求；2021年，CDE发布《生物类似药相似性评价与适应症外推技术指导原则》[2]，对生物类似药的定义、相似性评价体系、适应症外推原则等作了进一步阐述。 生物仿制药的相似性评价将贯穿整个研发过程，主要包括：药学性质研究、非临床研究、临床研究，其中药学相似性研究是支撑生物仿制药研究的基石。生物仿制药的药学性质研究主要包括理化性质、生物活性、纯度与杂质、免疫学性质四个方面。有效的药学对比分析实验依赖于可靠的分析方法和能力。本文主要针对生物仿制药药学性质的分析方法研究。
物理和化学特性
生物仿制药是由氨基酸残基通过肽键连接而成的蛋白质大分子药物，具有一级结构和高级结构[3-4]。生物仿制药的一级结构是指肽链中氨基酸的数量、组成和顺序，决定了高级结构的形成，而高级结构与生物仿制药的理化性质和功能直接对应。生物仿制药一级结构和高级结构的表征是生物仿制药理化性质研究的主要内容。
1.1 一级结构分析
一级结构是生物仿制药最基本的结构，是其高级结构和功能的基础，对药物的活性和稳定性有重要影响。一级结构研究项目主要包括：完整分子量、氨基酸序列及修饰、糖基化、二硫键分析等。
1.1.1 完整分子量分析
完整蛋白质分析不会破坏蛋白质样品，保证结构的完整性并保留翻译后修饰。色谱、电泳和质谱技术目前广泛应用于完整蛋白质分析，可以提供完整蛋白质的分子量等信息。完整蛋白质分析中常见的技术包括凝胶电泳、尺寸排阻（SEC）-高效液相色谱（HPLC）、基质辅助激光解吸电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）质谱。凝胶电泳和SEC-HPLC具有快速、便捷、重现性好的优点，广泛应用于不同开发阶段的生物仿制药和参比药的分子量对比分析。但这两种方法的质量精度相对较低，不能提供样品的精确分子量[5]。 MALDI和ESI质谱技术已成为测定完整蛋白质分子量最常用的方法之一，包括完整分子量、还原分子量、N-糖裂解后分子量以及轻重链分子量等。采用自上而下的分析策略，将完整分子量样品碎裂，然后进行质谱分析，可以表征氨基酸序列、氨基酸修饰和蛋白质亚型[6-8]。
1.1.2 氨基酸序列及修饰分析
基于质谱的肽图分析是生物仿制药氨基酸序列及修饰分析的常用方法。它是一种自下而上的方法[9]，利用高特异性的蛋白酶作用于特定的肽链位点将肽切割成小片段，基于纳液相色谱分离肽段，再利用高分辨率质谱进行分析。肽分析常用的蛋白酶包括胰蛋白酶、LysC、GluC、Asp-N、胃蛋白酶等，不同蛋白酶具有不同的特异性切割位点，使用不同的蛋白酶及联合使用可以提高序列覆盖率[10]。纳液相色谱-高分辨率质谱联用可以识别肽段序列及脱酰胺、氧化、糖基化等各种氨基酸修饰。 通过比较未修饰的末端肽，可以识别末端修饰的变化（例如 C 末端赖氨酸裂解和 N 末端焦谷氨酸形成）[11]。
1.1.3 糖基化分析
由于大部分生物仿制药采用哺乳细胞表达系统，细胞内存在复杂的翻译后修饰和酶反应，导致表达产物的糖基化分子结构多样性，生产工艺和细胞株的细微变化都可能导致目标蛋白糖修饰基团结构发生明显差异。糖基化对蛋白质的稳定性、构象、结合亲和力和活性等都有重要影响，是治疗性蛋白质药物的关键质量属性之一[12-13]。生物仿制药的糖基化主要以糖基化位点、组成和分支为特征。完整蛋白质的质量分析可以确定蛋白质的主要糖型，但很难确定糖基化位点。糖基化位点主要通过糖肽分析来识别。通常用胰蛋白酶等蛋白酶对完整蛋白质进行酶解，产生小肽。 经色谱或电泳分离后，可进行串联质谱分析，确定糖肽氨基酸序列和糖基化位点硫酸钠的相对分子质量，但糖肽分析对于寡糖类型的分析不够全面[14-15]。寡糖类型分析通常采用酶法或化学方法，将寡糖从完整蛋白质中游离出来[16-17]，例如N-糖苷酶F可裂解蛋白质结构中N-乙酰葡萄糖胺与天冬酰胺之间的酰胺键，肼解可裂解N连接寡糖，β-消除可裂解O连接寡糖。游离寡糖的分析方法通常有阴离子交换色谱法、直接质谱法和衍生化质谱法三种。寡糖结构不含发色团，常标有荧光试剂，用于光谱检测。 例如N-寡糖的分析常采用8-氨基萘-1,3,6-三磺酸作为衍生化试剂，衍生化后再用荧光进行检测。虽然质谱可以直接检测寡糖，但是利用衍生化试剂对寡糖进行衍生化可以大大提高质谱检测的电离效率，并提供更多的碎片结构信息。
1.1.4 二硫键分析
二硫键是多肽和蛋白质中常见的翻译后修饰，是由氨基酸序列中两个半胱氨酸残基的巯基氧化而形成的共价键。二硫键不太稳定，氧化形成的二硫键也可以被还原形成游离巯基，因此二硫键通常是动态变化的化学键。蛋白质和多肽中的二硫键对其热力学、力学和化学稳定性至关重要，也参与调控蛋白酶的抗性和活性。准确、快速地定位蛋白质和多肽中二硫键配对模式是研究其结构与功能的重要内容之一[18]。常用的二硫键分析方法是非还原酶水解-质谱法，利用酶对蛋白质进行非还原酶水解生成多肽。 通过质谱检测到每个肽的具体信息后，利用二硫键特异性搜索软件（pLink-SS）[19]对二硫键配对模式进行表征。
1.2 高级结构分析
生产工艺和制剂的改变可能导致维持蛋白质药物功能的高级结构发生变化，进而影响药物疗效和免疫原性。高级结构分析常用的方法有圆二色谱(CD)[20]、差示扫描量热法(DSC)[21]、氢-氘交换(HDX)-质谱(Mass MS)[22]等。远紫外CD数据可以反映蛋白质α螺旋、β折叠、转角和不规则卷曲的比例，可以快速计算出溶液中蛋白质的二级结构；近紫外CD数据可以反映蛋白质侧链发色团如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等残基的排列信息和二硫键微环境的变化，蕴含着丰富的蛋白质三级结构信息。通过测定蛋白质等生物大分子的CD，可以获得生物大分子的结构信息。 CD在蛋白质折叠、蛋白质构象研究及酶动力学等领域有着广泛的应用。DSC的工作原理是同时加热或冷却参比池和样品池中的缓冲液或样品，测量两者保持相同温度所需的热量差。DSC可以分析蛋白质高级结构的变化，研究各种贮存因素对制剂稳定性的影响。HDX-MS的基本原理是利用蛋白质中不稳定氢原子可以与溶液中的氘原子交换的特性来研究蛋白质结构。首先将蛋白质分子溶解在重水中，由于不同类型氢原子的氢-氘交换速率不同，蛋白质表面的氢原子与重水接触更紧密，交换速率比位于蛋白质内部或参与形成氢键或盐桥的氢更快。交换反应后，蛋白质被酶切，通过MS检测不同肽段的氢-氘交换速率，最终得到蛋白质的空间结构信息。 HDX-MS是研究蛋白质三维结构的有力工具，是传统生物物理方法的重要补充，广泛应用于蛋白质结构与动态变化研究、活性位点识别等。
内容由凡魔古编辑查阅文献后精选而成，排版编辑均为原创，若转载请尊重劳动成果并注明来自凡魔古公众号。
生物活性
生物活性测定是测定药物对机体生物学作用的方法，在生物仿制药的研发和质量控制中至关重要。生物活性测定方法包括：在体动物实验、基于细胞系的生物活性分析方法、基于转基因细胞系的生物活性分析方法。
动物实验通过测试药物在实验动物身上的药效学作用来反映药物的生物活性，在药物研发中起着重要作用。然而，动物实验复杂且变化性大，大多数动物实验已被细胞实验所取代。然而，动物实验方法，即网织红细胞法，仍然用于确定具有复杂作用机制的生物技术药物的体内生物活性，例如重组人促红细胞生成素（ERP）[23]。
随着高通量药物筛选平台的建立和生产规模的扩大，以及3R（、、）原则被科学家接受，人们越来越多地寻求动物实验的替代品。基于细胞的生物活性分析方法因其高通量、高效率、高精度等优势，越来越受到研究人员和制造商的青睐。许多生长因子的活性是由其对靶细胞的增殖促进作用决定的，例如表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）[24]。
对于没有强反应性细胞株或不易检测的细胞效应的生物技术药物，构建转基因细胞株成为一个很好的选择。转基因细胞株的构建是在对药物作用机制进行全面深入研究的基础上，通过体外模拟创新药物的信号转导机制，以引入药物作用受体报告基因或效应分子为策略，构建了一系列简便、快速、准确、安全、替代动物的转基因活性评价模型。余蕾等[25]将胰岛素促分泌肽天然受体的荧光素酶报告基因和信号分子cAMP同时引入CHO-K1细胞，建立了检测胰岛素促分泌肽融合蛋白生物活性的报告基因方法，并成功应用于胰岛素促分泌肽活性的测定。
纯度和杂质
纯度是生物技术药物的关键质量指标，生物类似药与原研药纯度的差异可能导致其在人体内的药代动力学特征和免疫原性不同，进而导致体内疗效的差异，甚至可能引起严重的过敏反应。杂质主要包括产品相关杂质和工艺相关杂质。
3.1 产品相关杂质分析
蛋白质药物在生产和储存过程中，可能由于错误折叠、不完全组装、降解、聚集等原因，产生不同分子量的产物，复杂的翻译修饰和降解过程可产生不同的电荷异构体，产品相关杂质主要包括分子量异构体和电荷异构体[26]。
3.1.1 分子量大小变异分析
SEC-HPLC和电泳是检测分子大小变异体的常用方法。SEC是根据凝胶孔径与聚合物样品分子大小的相对关系进行分离的分析方法。SEC的优点是应用简单、通量高；缺点是样品稀释可能导致可逆聚集体的解离，样品与色谱基质之间可能存在相互作用，从而减少聚集体的数量，影响单体蛋白的检测[27]。电泳法包括十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Gel，PAGE)和十二烷基硫酸钠毛细管电泳[28](-SDS，CESDS)。聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，具有分子筛效应，SDS-蛋白质复合物带过量的负电荷，质荷比近似恒定，它在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移与其分子量成比例。 CE-SDS是将凝胶填充在毛细管内，在毛细管内形成分子筛，SDS-蛋白质复合物按分子量大小在毛细管内迁移，可有效减少组分的扩散，分离效率高。非还原SDS-PAGE和非还原CESDS不破坏样品的二硫键，可以分析由二硫键连接的聚合物[29-30]。
3.1.2 电荷异构体分析
生物仿制药在生产和储存过程中，糖基化、降解、聚集等修饰和改变都会引起电荷分布的变化。电荷变异会影响药物的组织分布和药代动力学。例如，增加正电荷会增加药物的组织停滞，降低血清清除率；降低正电荷会降低药物的组织停滞，增加药物的全身清除率。电荷变异体是质量控制的重点，有效的质量控制非常必要。电荷异质性分析的常用方法包括平板等电聚焦（IEF）、离子交换色谱（Ion-，IEC）、毛细管区带电泳（Zone，CZE）、毛细管等电聚焦（CIEF）和成像毛细管等电聚焦（ICEF）。其中，IEF操作繁琐，分辨率低，定量不准确；IEC、CIEF、iCIEF具有良好的分辨率和定量优势；CZE通用性强，分析时间短，具有相当的分离度和准确性。 IEC、CZE和质谱法可用于进一步表征电荷异构体的分子量、序列、氨基修饰和其他特性[32-33]。
3.2 工艺相关杂质分析
生物技术药物一般由微生物或细胞表达后进行纯化，纯化过程中残留的宿主DNA、残留宿主蛋白（HCP）、亲和介质蛋白A（A、ProA）的脱落等均对人体构成安全威胁，工艺相关杂质是影响生物技术药物纯度的另一关键因素。
3.2.1 宿主残留DNA检测
残留DNA可能带来感染或致突变风险，如连续培养细胞中的DNA具有致瘤性[34]。2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）第四部[35]规定CHO细胞中残留DNA不得超过10pg/剂。《中国药典》第四部收录的宿主残留DNA检测方法有三种：DNA探针杂交法、荧光染色法和荧光定量PCR法。其中，DNA探针杂交法繁琐费时，不能定量分析；荧光染色法特异性差，灵敏度低；荧光定量PCR法具有灵敏度高、准确性好、简便快速等优点，是检测DNA残留的常用方法[36]。
3.2.2 HCP检测
HCP具有诱发免疫反应的潜在安全风险，常见的检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）和高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）。ELISA主要依靠抗体对HCP的特异性识别，具有灵敏度高、检测简单等优点，但HCP特异性抗体制备周期长、成本高、失败风险高，且无法检测因工艺改变而新引入的残留蛋白，无法对HCP进行定性分析。与传统ELISA法相比，HPLC-MS法开发时间短（仅需数周），且可对所有HCP进行无偏的定性和定量分析，在HCP杂质分析中越来越常用[37-38]。
3.2.3 Pro A残留检测
Pro A来源于金黄色葡萄球菌，含有5个结构域，能与抗体IgG分子的Fc段特异结合，是一种抗体结合蛋白，被广泛用作纯化Fc融合蛋白和单克隆抗体的亲和介质[39]。在抗体纯化过程中，Pro A可从柱子中浸出，造成污染。Pro A作为金黄色葡萄球菌的膜蛋白，具有免疫原性，控制其残留水平是保证药物安全的重要指标。ELISA是Pro A残留的主要检测方法，但Pro A能与IgG分子结合，从而阻碍其与相应抗体的结合，常导致检测结果不准确。因此，在建立Pro A检测方法时，应考察方法的精密度和准确度[40]。
免疫学特性
免疫学特性是指药物刺激机体形成特异性抗体或致敏淋巴细胞的特性。免疫学特性评价是生物仿制药质量控制的重要内容，主要包括生物仿制药与FcRn、Fcγ、c1q等靶点和受体的亲和力、补体依赖性细胞毒活性（CDC）以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性（ADCC）。
4.1 对靶标和受体亲和力的评估
评价生物仿制药与靶点及受体亲和力的主要方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、细胞酶联免疫吸附试验（）[41]、表面等离子体共振（SPR）滴度测定法[42-43]。ELISA是评价药物与靶点及受体亲和力的常用方法，操作相对简单，耐久性好，但需要制备抗原。细胞酶联免疫吸附试验（ELISA）与ELISA的原理基本相同，只是将可溶性抗原展示于细胞表面，通过流式细胞术测定细胞阳性率指数，检测受试抗体与标记抗体的竞争性结合。该方法的优点是避免了抗原的制备和纯化过程，特别适用于难以制备的抗原；展示于细胞表面的抗原的空间结构更接近于在体内的存在形态，使检测结果更能反映药物在体内的活性状态。
SPR是分析生物分子间相互作用的新技术，被正式收录于2020版中国药典第四部。其具体测量过程为：将抗体固定在芯片表面，待测抗原通过微流控系统流过芯片。抗原抗体一旦结合，芯片表面物质的质量浓度就会升高，从而引起芯片表面液体的折射率发生变化而被检测到。该技术在测量抗原抗体结合活性时不需要标记，避免了标记对分子结构的影响，能更真实地反映抗原与抗体的结合情况。其测量周期短，所需样品量少，一般仅在微克级，可用于微量样品的测量。 SPR技术可用于抗体-抗原结合活性分析、抗体候选物的筛选与评价、以及抗体-受体结合活性分析，如抗体与FcγRIIIa、FcγRIIIb等受体结合的亲和力、动力学信息等。
4.2 CDC活性测定
CDC是指补体的细胞毒作用，即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原的结合，抗体Fc片段的补体结合位点暴露出来，与补体C1结合形成复合物，激活经典补体途径，形成的膜攻击复合物（MAC）引起细胞外离子大量内流，最终导致肿瘤细胞裂解。抗CD20
单克隆抗体[44]的活性主要由CDC决定。选择CD(of)抗原表达较高的细胞接种，使抗体能充分与细胞表面抗原结合，然后加入补体孵育硫酸钠的相对分子质量，与细胞表面结合的抗体激活补体成分，杀伤细胞。补体成分多，热不稳定，易失活，其来源包括正常人血清、豚鼠、兔等。补体的选择及其质量的控制是CDC活性测定的关键环节。
4.3 ADCC活性测定
ADCC是指抗体药物通过Fab片段特异性地与靶细胞（病毒感染细胞和肿瘤细胞）表面的抗原决定簇结合的过程。抗体药物的FC片段可被NK细胞等细胞毒性细胞的Fc受体（FcR）识别并结合，从而杀死靶细胞。早期的ADCC验证方法多以新鲜制备的外周血单核细胞或NK细胞作为效应细胞进行杀伤试验，但这些方法存在细胞分类培养困难、操作繁琐、背景值高、受个体差异影响等缺点。研究[45]表明，NK细胞中Fc受体（FcR）活化，特别是受体（CD16）活化，可以激活活化T细胞的核因子（NF-κB）。NFAT信号通路是一条调控荧光素酶表达的通路。 利用基因工程方法在细胞表面稳定表达Fc受体，构建细胞内NFAT信号驱动荧光素酶表达的基因回路，将荧光素酶与生物发光偶联。当抗体Fc片段与细胞表面Fc受体结合时，NFAT信号通路受到刺激，荧光素酶表达增加，通过生物发光测定ADCC活性。该方法简便易操作，特异性强，重复性好，准确性高，可直接检测抗体Fc片段与Fc受体结合的能力[46]。
结论
生物仿制药分子量大、结构多，对其质量控制提出挑战。应采用先进、灵敏的方法通过比对试验研究生物仿制药的理化性质、生物活性、杂质与纯度、免疫学性质等药剂学性质。首先可考虑采用与参比药一致的方法，对于其他技术和方法应提供依据，对于某些关键质量属性，应采用多种方法进行比较试验。本文整理了生物仿制药药剂学性质的研究项目和分析方法，对国内生物仿制药研发企业的质量控制具有重要的指导作用和参考价值。
扫描微信二维码，添加抗体圈编辑，符合条件的即可加入抗体圈微信群！
转载请注明：姓名+研究方向！