概括
与其他精密仪器相比，光学显微镜作为材料表征的常规手段在制药和精细化工行业一直被严重忽视。 光学显微镜无疑在样品制备中发挥着重要作用，但它也可以在固体性质的研究中发挥重要作用。 本文的主要目的是纠正这种不平衡（对于光学显微镜应用）并说明光学显微镜，特别是偏振光显微镜，应该在大多数材料表征中占有一席之地。 偏光显微镜的使用不应仅限于了解所研究化合物的性质； 它应该是解决有机和无机化合物发现和开发中遇到的难题以全面了解它们的不可或缺的工具。 当使用各种技术来研究化合物的固体性质时，偏光显微镜对于理解和解释其他技术发现的现象有很大帮助。 简单地在不同放大倍率下观察小样本即可获得其他非光学仪器无法比拟的有价值的信息。 偏光显微镜本身是一种独立而强大的技术手段偏光显微镜补偿器的作用，应该成为其他固态表征技术如XRD、热分析、固态核磁共振、振动光谱等的首要补充。本章重点介绍偏光显微镜的实际应用。光学显微镜以及为什么它是其他工具的强大辅助工具。
为什么使用光学显微镜来研究固体的性质？
显微观察的目的是通过放大样本图像来揭示肉眼根本看不见的信息。 当光学显微镜添加偏光滤光片后，它就成为一种分析工具，可用于确定晶体的光学性质并进行微量化学实验。 不同的固体结构具有不同的光学特性，例如折射率、颜色、消光角和光色散，可以使用光学结晶方法快速确定。 光学性质是由晶体结构和晶体本身的化学性质决定的，因此光学性质可以提供很多有价值的信息来支持其他方法获得的数据。 此外，通过偏光显微镜可以快速获得诸如颗粒尺寸、颗粒性质、机械性能、孪晶、包合物、晶体生长和烧蚀、介晶等信息。 通过使用热台显微镜加热或冷却小样品，可以观察到热诱发现象，例如熔点、晶态转变、溶剂化物和升华。 除了光学显微镜之外，还有许多其他显微镜用于探索和分析样品的材料和化学性质，例如配备X射线的电子显微镜、原子力显微镜（AFM）、红外拉曼显微镜、近红外显微镜和声学显微镜。
偏光显微镜
偏光显微镜（图 1）是一种复合显微镜，由放置在样本上方（分析器）和下方（偏振器）的偏光滤光片组成。 检偏器和起偏器处于正交位置。 偏光镜在光路中的位置始终位于样品和光源之间（通常与聚光镜集成），以确保通过偏振光观察样品。 分析仪放置在光路中，以便可以通过交叉偏振检测样品。 一些偏光显微镜的分析仪可以旋转，以便可以在非交叉偏振条件下检查样品，或者可以表征光学活性样品，或者可以使用特殊的补偿板。 为了获得均匀的亮场，必须将显微镜调整（如果可能）以适应科勒条件。
图1 偏光显微镜示意图
为了确保在偏振光下对样品进行全面观察，显微镜必须配备可旋转的载物台，以便单个晶体能够分别与分析器和偏振器的振动方向对齐。 至少一个目镜必须有十字准线，以指示检偏器和起偏器的振动方向。 旋转台的边缘应有刻度和游标以测量角度，例如晶面的角度或晶体的消光角。 补偿器（例如色相板）对于确定晶体的其他光学特性非常有用，通常安装在分析仪下方的光路中。
为研究晶体的固体性质而选择的偏光显微镜应具有以下基本配置：
显微照相术
显微照相术是记录显微镜产生的小物质图像的技术。 在检查样品时，拍摄其呈现的形态非常有用，以便在将来的报告中参考或说明。 相机通常安装在预先准备好的三目镜头上或通过适配器连接到其中一个目镜。 随着高性能数码相机的诞生，将它们配备在显微镜上使显微摄影变得更加容易和快捷。 然而，获得理想的结果也离不开样品制备的质量以及对基本显微摄影技能的理解和应用。 优良的性能只是前提，专业的技术才是品质的保证。 仅仅说明图片中的放大倍数是不够的，还必须有比例尺，因为原始图像会因图片尺寸的不同而发生变化，但比例尺不受这些因素的影响。 因为比例尺所代表的尺寸是由已知精确尺寸的载物台千分尺（载物台）或载物台计数线（载物台）确定的。 显微镜专用数码相机一般都具有比例尺自动叠加功能。
样品制备
与所有分析技术一样，正确的样品制备是获得有价值的测试结果的先决条件。 理想情况下，样品应具有足够的代表性，并且在样品制备过程中不应以任何方式破坏样品本身的状态和性质。 样品范围从结晶化合物到含有颗粒的粉末。 粉末样品样品的制备比较简单，只需将其分散在合适的液体中并铺在载玻片上即可。 但要准备一个合理的样本，从一开始就必须有明确的目的。 例如，如果要分析样品的粒径，则必须确保样品与背景之间有足够的对比度（看不到如何测量）。 样品与周围环境之间的对比度可以通过将样品分散在与其自身折射率显着不同的液体中来实现。 许多有机固体材料的折射率在1.50至1.70之间。 硅油的折射率仅为1.40，几乎呈化学惰性，使其成为一种合理的载体。 其他可用于分散的液体包括矿物油、水、浸油等。基本原理是分散的样品不溶于分散液。 对于粉末样品，一般样品制备方法如下：
1) 将一滴或几滴选定的分散体添加到干净的载玻片上（含有较大颗粒的样品需要稍微多一点的分散体来填充载玻片和盖玻片之间的间隙）。
2) 使用微量进样器将样品加载到载玻片上，并使用圆周或之字形运动使样品均匀地分散在分散液中。 分散过程中注意不要破坏样品形状或产生气泡。
3) 盖上盖玻片，从尽可能最小的角度开始，以避免气泡。 盖玻片和载玻片之间的空间应充满分散液，一侧的样品会随着分散液在间隙之间移动，影响观察。 同时，使用镜头清洁纸或滤纸擦去盖玻片边缘周围多余的色散，以免污染镜头和载物台。
使用偏光显微镜观察
关于晶体材料光学性质的最有价值的信息通常可以使用偏光显微镜获得。 无论是药物、矿物、炸药、杀虫剂、颜料还是陶瓷，每种物质的晶体形式都具有可用于识别的特征光学特性。 使用偏光显微镜，可以轻松地在不同条件下观察样品，无需其他辅助设备。 这些不同的条件包括：非偏振光、平面偏振光、圆偏振光、正交偏振器、非正交偏振器。 下面结合实际应用对其进行介绍。
6.1. 偏振光
振动方向和传播方向在各个方向上都垂直的光是非偏振光。 一般来说，这种非偏振光除了观察颗粒大小和性质外，对于晶体材料没有更多的用处。 当非偏振光遇到偏振滤光片时，只有振动方向平行于滤光片光栅的光才能通过，成为平面偏振光（平面光）。 当平面偏振光直接到达检偏器（与偏振器成90°角）时，没有光可以通过，视野是暗的。 这种情况称为正交偏振器 ( )。
图2 偏振光路示意图
6.2. 使用平面偏振光研究晶体
由于平面偏振光的振动方向已知，因此只需旋转载物台即可在不同方向观察单晶。 平面偏振光有两个主要应用：
Ø通过偏振光方向定位各向异性晶体化合物并测定其折射率。 如果使用非偏振光测量折射率，则测量每个方向上的折射率的平均值。 对于各向同性晶体，不需要使用平面偏振光，因为折射率与方向无关。
Ø测定各向异性晶体化合物在特定振动方向上的吸收色。 当有色晶体化合物在平面偏振光照射下旋转时，其颜色或颜色强度发生变化，称为二色性或多色性。 当用非平面偏振光观察时，颜色在所有方向上是平均的。
对于各向同性晶体（在一定温度和波长下），光以相同的速度向各个方向传播，因此各向同性晶体只有一个折射率。 其他各向异性晶体化合物具有两个或三个折射率。 当偏振光进入各向异性化合物时，根据传播速度，它会分解成快、慢方向上两个相互垂直的振动波。 当两个方向的光波穿过该化合物时，慢速方向的传播相对延迟。 解释不同方向折射率的一种便捷方法是构建称为折射率椭球 () 的三维模型。 折射率以半径的形式显示，半径的长度与折射率的大小成正比。 对于各向同性物质，折射率椭球体是圆形的（图3，a），因为折射率在所有方向上都是相同的，唯一可变的是尺寸，尺寸随折射率而变化。
对于具有两个折射率的物质，折射率椭球体是旋转球体。 三方晶系、四方晶系和六方晶系均具有常规和非常规两个射线轴，对应的折射率分别为nω和nε。 两个射线轴的任一方向都可以是快传播方向或慢传播方向。 常规波的振动方向与晶体光轴平行，表现出各向同性。 传播方向为球形并具有圆形横截面 (C)。 非常规波的振动方向垂直于C面。 两种波合成的结果是折射率椭球体呈椭球体形状（图3，b）。 唯一的光轴是垂直于 C 截面的 OA。 只有一个光轴的晶体称为单轴晶体()。
单斜晶、三斜晶、斜方晶具有三个相互垂直的射线轴，对应的折射率分别为α、β、γ。 α 的值最小（传播最快），γ 的值最大但传播最慢。 其折射率椭球为三轴椭球（图3，c）。 三轴椭球中有两个相交的圆形截面C'和C''，均以β折射率为半径。 每个横截面都有与其垂直的光轴A'和A''。 光轴所在的平面称为光轴平面，这个平面也是α、γ对应的光线轴所在的平面。 具有两个光轴的晶体称为双轴晶体（.）。
两个光轴之间的锐角称为光轴角（2V），它与折射率有关，对于相应的化合物来说是一个常数。 对于单轴晶体和双轴晶体，光轴和射线轴之间存在一定的对应关系。 例如，对于三方晶系、四方晶系和六方晶系，光轴和光线轴是重合的。 对于斜方晶系，任意光轴可以与任意光线轴重合。 对于三斜晶系，任何光轴和射线轴都不重合。
图3 不同类型折射率椭球示意图
6.3. 使用偏振光研究晶体
使用平面偏振光时，如果未放置样品或放置各向同性晶体样品时视场较暗，则对于各向异性晶体，除非从光轴方向观察或样品正好处于消光位置，否则样品将由于双折射而产生双折射。 非凡的景色将是明亮的。 当使用非偏振光时，可以同时观察各向同性和各向异性样品。 对于各向异性样品，也可以观察到干涉色和消光位置，但此时的观察结果与使用正交偏振光观察到的结果不同。 结果不一致偏光显微镜补偿器的作用，因此非正交偏振光仅用于观察混合样品，一般不用于测量晶体材料的光学性质。
由于光在各向异性晶体中传播时，一个方向的传播滞后于另一个方向，因此可以使用正交偏振光观察到干涉光（ ）。 当两个方向都穿过晶体时，这种解构和重建光的过程然后在分析器中再次组合。 干涉色分为不同的颜色级别，一般出现在边缘的斜角处。 通常在较薄的边缘观察到低水平干涉色，随着晶体厚度的增加，颜色水平向更高阶移动。 图4是一水乳糖的偏振光照片。 中心为五阶绿色，边缘处可观察到二阶红色。 晶体中的色带随着晶体的厚度而变化，类似于图中的等高线。 色带越接近，晶体表面越“陡峭”。
图4 一水乳糖的偏振光干涉色图
晶体的干涉色除了与厚度有关外，还与观察晶体的方向有关。 如图 5 所示，对于具有随机分布方向的化合物，可以观察到一系列不同的干涉色。 因此，单纯依靠干涉色并不能确定晶体的方向。 区分不同的晶体。
图5 某结晶化合物的偏振光图片
消光() 当用正交偏振光观察双折射晶体时，由于消光现象，载物台每旋转90°，视野就会变暗。 当消光发生时，晶体中光振动的方向与起偏器或检偏器的方向一致（光活性物质除外）。 消光角基于目镜中的十字准线。 此时十字准线的位置必须与起偏器、检偏器严格一致。 当消光位置与晶体性质的关系确定后，就可以作为特定晶系的标志。
如图6-a所示，当消光发生在晶体较长边且与十字线平行时，此时的消光位置为线状光（ ）； 如图6-b所示，当消光位置与十字线成一定角度时，称为斜消光（或），表示消光角度一般不超过45°； 如下图6-c所示，当消光位置出现在十字平分两个相邻晶面夹角时，为对称消光（ ）； 如图6-d所示，当发生波状消光( )时，可以看到随着载物台旋转，晶体表面有黑色区域移动，这种情况通常发生在弯曲或具有高张力的晶体中。
图6 不同类型灭绝示意图
另外，有些晶体并不完全表现出消光，而是发生干涉色的变化，称为异常消光（或）。 造成这种现象的原因是不同干涉色的消光位置不同。 当晶体具有干涉色但没有消光位置时，该晶体可能是多晶。 当在较大的放大倍数下观察时，可以看到许多晶体在任何时刻都处于不同的消光位置； 也可能是孪晶，当一个晶面灭绝时，另一个晶面不会灭绝。
折射率
样品的折射率会严重影响样品的可观测性，也可用于识别物质。 它是物质最重要的光学性质之一。 通过增加分散体和样品之间的折射率差可以改善物质的可观测性。 折射率是真空中的光速与物质中的光速之比，并且始终大于1。对于任何物质，折射率都是恒定的，仅取决于波长和温度。 折射率越大，传播速度越慢。 使用超过一种折射率的物质被称为双折射。 双折射是指各向异性物质的最大和最小折射率之间的数值差。 例如，碳酸钙晶体的两个折射率为1.658/1.486，其双折射率为0.172。 各向同性物质不存在双折射。 物质的折射率由其原子和分子决定。 如果一种物质具有较大的双折射，即使其晶体结构未知，也可以预测其分子将如何堆积。 当预测结果与显微镜下观察到的晶体性质（如针状）一致时才更有意义。 例如，平面分子倾向于彼此平行排列，使晶体具有针状形状，而细长分子倾向于顺序排列，使晶体具有层状形状。
7.1. 折射率的测定
样品的折射率可以通过浸渍法来测定。 将待测样品浸入已知折射率的液体中。 当待测样品的折射率与浸入液体的折射率相差较大时，样品清晰可见。 随着折射率降低，当样品和浸入液体的折射率相同时，样品变得不可见，浸入液体的折射率就是样品的折射率。 大多数商业渗透溶液都是有机试剂，存在溶解样品的风险。 如果溶解过程缓慢，则测得的折射率相对接近实际值。 如果溶解较快，则需将浸润液预饱和，然后用折光仪测量饱和溶液的折射率，进而检测样品的折射率。
可以使用多种方法来确定样品和浸润液的折射率何时相同。 这些方法中最常用的是 Becke 检验。 该方法简单易行，可区分0.001的折射率差。 Becke测试是通过比较样品和渗透液的折射率来进行的。 如果使用非偏振光，则测量各向异性材料的平均折射率。
7.2. 贝克测试
贝克测试是通过样品和渗透溶液边缘的明亮光晕（称为贝克线）进行的。 当样品上下聚焦时，贝克线在样品和渗透溶液边缘之间的界面上来回移动。 执行贝克测试的一个简单规则是“从下到上”或“从低到高”。 随着目镜和样品之间的距离变小（将载物台向上移动），贝克线将从折射率较大的一侧移动到折射率较小的一侧，反之亦然。 如图7所示，在该图中，色散的折射率大于样品的折射率。 当样品和浸润溶液的折射率相同时，贝克线消失。
图测试图
粒径
光学显微镜可以有效测量1-400μm范围内的颗粒（粉末）的粒径。 但如果要准确检测小于5μm的粉末粒径，建议使用扫描电子显微镜。 当目镜中装有刻度时，可以测量观察到的颗粒，但必须对刻度进行校准。 对于球形颗粒（在药物中很少遇到），仅直径就足以描述其尺寸。 对于非球形颗粒，许多统计粒径也用来描述其尺寸，如费雷特直径、直径和投影直径等。在比较不同样品之间的粒径时，没有必要每次都进行精确的粒径分布测量。时间。 光学显微镜也可用于快速分析。 平均粒径可以通过观察制备的样品中不同尺寸的颗粒来获得。 这种方法虽然不够准确，但方便快捷，足以区分粒径差异较大的样品。
颗粒形状
结晶物质的外观或结晶度尤其由其内部分子结构决定。 目前，有许多晶体学现象专门用于描述七种晶系中存在的各种晶习。 在常规显微观察中，识别晶型（如斜方晶系、复杂六方双锥晶族、楔形晶族等）是不现实或不必要的，特别是当晶型的外观仅因外观不同而不同时。由于生长过程中晶面形成不均匀而引起的。 但是，当晶体学以更简洁和易于理解的方式描述时，它非常适合检测晶体化合物的批次间差异。 另外，晶瘾对药物的压片性和溶出度影响很大。
已识别六种晶体形状，它们可以出现在七种晶体系统中的任何一种中。 USP也用它们来描述晶体形状，下面将单独描述。 原理图如图8所示。
图8 不同晶体特性示意图
等径（）晶体：如立方体或球形晶体
板（）晶：扁平，长宽接近厚度且稍薄
片状晶体：扁平，长宽接近厚度，比板材薄
板条：细长、薄的刀片状晶体
针状（）晶体：高度细长，细长，横截面近似方形或圆形
柱（）晶：拉伸棱柱状，宽度和厚度均大于针状
在描述晶体形状时必须谨慎使用六边形、立方体和菱形等词语，因为这些高度具体的描述在使用时意味着对它们所属的晶体系统有足够的了解。 相反，诸如六边形、立方体、菱形和岩石之类的描述更合适且信息丰富。 有时晶体也会表现出特殊的特征，有时是几何形状，例如正方形或菱形。 因此，晶体也可描述为：正方形、长方形或菱形板状晶体，三角形片状晶体或点状片状晶体。 晶体有许多不同的形状。 在粉末状晶体材料中，根据不同晶面的生长速率，可能会出现一系列不同的形状。 在大量呈现六角形的板状晶体中，有些可能呈现三角形或菱形。 被压碎或研磨的粉末不再提供有关原始晶体外观的任何信息。
除了以上对晶体性质的描述外，使用以下术语来描述晶体外观可以提供更全面和丰富的信息。
图9 不同晶粒外观示意图
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比较粉末样品
观察样品时，最好拍照，比较不同批次样品之间的差异。 这些差异可能包括颗粒外观和颗粒尺寸。 如果它们都以相同的倍数观察，这种比较会更方便。 最好还有相关且简短的描述。 样品观察报告应包括但不限于以下内容：
下面以显微镜观察天冬氨酸为例，图片如图10所示。样品为针状、板条状、板状和棱柱状无色粉末的混合物。 针状、板条状和棱柱状颗粒的长度范围为50-600μm（大多在150μm左右），这些颗粒的长宽比范围为2：1至15：1。 当使用偏振光观察时，这些颗粒具有明亮的干涉光，每旋转 90 度就会消失，表明它们是晶体材料。 将样品粉末分散在硅油中并使用尼康POL显微镜观察。
图10 天冬氨酸的显微镜图片
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热台显微镜
通过在载物台上放置热载物台，可以使用热载物台显微镜在加热（冷却）时观察样品。 示意图如下。 作为一种分析方法，热台显微镜可以用来观察由热力学引起的一系列现象，如熔化、结晶、升华、去溶剂化、相变和热致结晶等。 此外，由于它可以快速分析热力学相图，因此在一定程度上也可以与DSC、DTA、TGA等热分析方法相互补充。
图11 偏光显微镜加热台示意图
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显微镜作为微型实验室
除了观察和表征晶体化合物外，偏光显微镜还可用于观察晶体生长。 此外，还可以观察到溶液介导的结晶转变。 溶液机制中的相变和固体机制中的引导的一个很好的例子是硝酸钾。 当将一滴稍不饱和的硝酸钾溶液加入到载玻片上时（不加盖玻片，液体在室温下可以缓慢蒸发），随着液体的蒸发，首先会在载玻片的边缘看到菱面体亚稳β晶体。水滴。 出现（图 12-1）。 短时间后，观察到在室温下稳定的高双折射板状 α 晶体的出现。 随着α晶体生长，溶解机制会发生相变，导致与α晶体生长方向相邻的β晶体溶解（图12-2）。 当α晶体在生长过程中接触到剩余的β晶体时，会同时再次发生。 通过固相机制的相变，最终液滴中的所有晶体都会转变为α晶体。
图12 硝酸钾晶体转变过程的显微镜图片
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多色性
许多有机和无机化合物都是有色的，有时可以通过颜色来区分不同的晶型。 例如，碘化汞在室温下具有四方晶系。 稳定相为红色，亚稳态为橙色。 当温度高于127°C时，其稳定相变为黄色的原骨。 领带。 红色和黄相之间的过渡是可逆的，可以使用偏光显微镜在肉眼中观察到。 具有不同颜色的不同结晶形式的这种现象称为“颜色多态性（颜色）”。 这种现象的原因是不同晶体形式之间构象的差异。 当使用白色平面偏振光观察到透明的彩色晶体时，晶体的颜色或颜色的强度通常会随着阶段旋转而变化。 这种变化的原因是晶体材料在特定的振动方向上选择性吸收。
无色或各向同性晶体化合物通常不表现出多色体性。 另外，如果某些有色晶体的吸收在各个方向相对较近，则不会表现出多色体性。 但是，当将高度双折射的无色晶体分散在液体中时，液体的折射率接近晶体的主要折射率之一，当平面偏振光下旋转时，可能会发生胸肌。 有时，晶体的颜色也可能是由晶体内部和表面上的彩色杂质引起的。 具有肾小球体的有机化合物通常包含发色团（偶氮组，共轭乙烯基基团等）。 当光振动的方向与发色团的方向一致时，光的吸收最强。 因此，在没有缺少XRD数据的情况下，如果在化合物中观察到胸肌，它还可以提供有关化合物分子的排列和填料的有用信息。
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晶体机械性能
在药用化合物开发的早期阶段，由于样品数量少，纳米凹痕仪器通常只能用于检测机械性能，例如硬度，弹性粘度，可塑性和脆性。 但是，光学显微镜也可以用于对物质进行定性分析，例如该物质是否经历塑性变形或脆性断裂，以及物理性能是软的还是硬性的。在载玻片上，加载盖板，轻轻按下盖子或进行相对运动，然后将其放在显微镜下进行观察。 对于硬，脆弱和破碎的样品，它们将以灰尘的形式出现。 具有柔软塑性变形的样品将被拉伸或粘稠，甚至在上下载玻片上留下痕迹。
图13具有不同机械性能的样品的显微镜图片
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假象
当晶体化合物发生物理或化学变化（例如其溶剂化或相变）时，由于晶体的内部结构的变化，其晶体外观可能会发生变化，有时甚至导致由于重大变化而导致晶体解构数量。 但是有时这种变化也可能是无损的：晶体变化的内部结构，但其外观不会改变。 这种现象称为假态（）。 在空气中加热时，许多水合物或溶剂化物将失去相应的晶体水和溶剂。 由于密度或排列的变化，晶体可能会变成多态性，并且当通过传播光观察时，晶体通常是朦胧或朦胧的。 紧的。 草酸二氢酸酯就是一个例子。 当高于60°C以上的加热时，由于水分流失而导致无色（白色）水合物变为无透明的无水。
图14水分流失之前和之后的草酸二氢酸酯的显微镜图片
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结论
看你！
译者注：
本文摘自《光明》一章
