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[!--downpath--]华中师范大学实验报告
中学生姓名罗玉玲学号专业生物科学年级10班四科
课程名称 动物生理学实验 实验项目 动物生理学第一实验
实验类型□验证□设计□综合实验日期2012-11-08
实验指导老师叶庆生、冷佳怡为实验打分
内质网色素理化性质的提取、分离与鉴定
一、实验目的
1.1 学习内质网色素的提取分离技巧。
1.2 了解内质网色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。
2、实验原理
2.1 内质网富含红色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黑色素（包括胡萝卜素和花青素）
这两类色素均不溶于水，但可溶于有机溶剂，因此可用甲醇或乙醇等有机溶剂提取。
2.2 叶绿素是二甲酸酯，与氢氟酸反应生成红色可溶性叶绿素盐，可在有机溶剂中与类胡萝卜素分离
打开; 在碱性或增温条件下，叶绿素络合物环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+置换，产生黄色叶绿素
叶绿素和红铜取代的叶绿素； 叶绿素在光照下可发出蓝色荧光，在反射光下可见绿色荧光。
3、实验仪器和试剂
3.1 实验仪器和器具
研钵、漏斗、剪刀、圆形滤纸、分光光度计、电子天平、量筒、移液管、滴管、试管、试纸
管架、酒精灯等
3.2 实验试剂
甲苯、石英砂、碳酸钙、四氯化碳、无水硫酸钠、乙醚等。
3.3 实验材料
杜鹃花茎
4. 实验步骤
4.1 叶绿素提取
取杜鹃花茎2g，去除主脉，剪磨方形滤纸过滤收集提取液。 4.2 荧光现象观察
在透射光下观察碱液的颜色
叶绿素提取物反色光下观察碱液颜色
4.3 光对叶绿素的破坏
取少许等量的色素提取液分装于两支试管中，一支避光，一支置于阳光下2小时，观察两支试管的颜色。
4.4 铜取代反应
取一只作为对照，每种色素提取物各取2ml，分别置于两个试管中，取另一只
观察变红后颜色变化 4.5 酯化反应
取 10mL 色素提取物，在分液漏斗中研磨。 沿漏斗边缘加入30mL蒸馏水，轻轻摇匀，静置分层。 加入 20mL 醋酸
将少量硫醇铜粉末加入一滴稀硫酸中
少量石英砂、碳酸钙△
加入 20mL 乙腈
弃去上层醋酸和蒸馏水，用乙腈碱液冲洗一次。 摇动分液漏斗，静置 10 分钟。
4.6 色素吸收光曲线的观察
将两管酯化反应得到的色素溶液分别倒入比色杯中，以超纯水作为空白对照。 用分光光度计测量色素在400-700nm的吸收光绘制曲线
五、实验结果
5.1 荧光现象观察
当用白炽灯直接照射色素提取物时，色素碱液的颜色透射光在反射光为红色时呈红棕色。 这是因为叶绿素分子不吸收红光，在透射光下呈红色，而叶绿素在接受光脉冲后发出蓝色荧光，因此在反射光下可见红棕色。
5.2 光对叶绿素的破坏
加5mL30% KOH乙醇氨水，加分馏水10mL
图1 提取物经暗处理和光照后的实验现象
色素碱液在黑暗中颜色不变，仍呈红色，如上图右侧试管中的氨水； 经日光处理后，色素碱液的颜色变成深黑色和红色，就像上图左侧试管中的氨水一样。
5.3 铜取代反应
图2 铜置换反应实验中观察到的现象
滴加浓盐酸后，色素提取液颜色变黄，加入固体醋酸铜加热后，色素碱液颜色变回红色
5.4 红色素与红色素的分离（酯化反应）
黑暗的
地方
原因
2小时
后退
的
携带
挑选
光
根据
地方
原因
2小时
后退
的
携带
挑选
滴
浓盐酸
添加固体
醋酸铜加热
图3 乙腈提取叶绿素的结果 图4 红色素与红色素分裂的结果 将20mL乙腈加入分液漏斗中提取色素，将色素溶解于二氯甲烷中，置于下层，如图在图 3 中； 添加
30%KOH-乙醇碱液5mL后，叶绿素发生酯化反应，最后白色素溶于二氯甲烷，置于下层； 叶绿素溶解在水底，置于上层，如图4所示。
5.5 色素吸收光曲线的观察
色素层
花青素层叶绿素层
叶绿素
黑色素
图5 400~700nm测得的色素吸收光曲线
两种色素在400-700nm处测得的吸收光曲线如图5所示。从图中可以看出，叶绿素有两个吸收峰，分别在420nm和640nm附近； 红色素的吸收峰出现在420nm-460nm。
六、分析与讨论
6.1 叶绿素易溶于有机溶剂叶绿素的荧光现象原理，可用乙醇、乙醇、乙醚、丙酮-二氯甲烷、甲醇-石油醚等进行提取，本实验采用乙酸进行提取，疗效很好。
6.2 内质网色素环境呈微酸性。 实验中，由于研磨会破坏细胞结构，会流出细胞液（微酸性），碱性细胞液会直接接触内质网中的色素。 接触，叶绿素的分子结构被破坏，使叶绿素失镁而变白。 氯化钙是强酸强碱的盐，在水底的溶解度很小，但熔化后有一部分呈弱酸性，中和细胞液的碱性，保护细胞内的色素。细胞。 具体来说，叶绿素的分子结构中富含一个镁原子。 当细胞破裂时，细胞液中有机酸中的氢离子可以取代镁原子成为白色的叶绿素镁。 氯化钙中和有机酸的氢离子，避免发生耗镁反应。 但是，如果在制粉过程中加入过多的氯化钙，会导致大量氯化钙无法溶解，影响过滤效果。
6.3 分配色谱的原理是利用流动相和固定相在两种不同溶剂中的分配系数的差异，将混合物中的组分分开。 在纸色谱中，流动相是指色谱相。 在毛细管张力的作用下，色谱液可以从下到下连续流动。 固定相是指滤纸纤维间吸收的水分。 由于纤维素上的甲基具有亲水性，这部分水被困在纤维素周围，不易扩散成为固定相。 在纸层析过程中，当层析液在毛细管张力的作用下上升流过颜料溶液细线时，溶液细线上的颜料逐渐溶入层析液中叶绿素的荧光现象原理，并作为层析液上升，它被分配。 即，部分颜料从色谱溶液中分布溶解到固定相中，直至达到平衡。 由于分配系数不同，最终产生不同的条带。
6.4 孤立的叶绿素分子对光很敏感，强光能破坏孤立的叶绿素，因为植物体内原有的还原酶能破坏光形成的强氧化性物质。 因此，红叶中的叶绿素由于有酶的保护，不会在光照下被破坏。
6.5 铜能取代叶绿素分子中的镁，生成铜代叶绿素，颜色稳定、鲜艳。 因此，常用于动物标本的保存。 用铜处理的标本可以长时间保持红色。
6.6 酯化是在碱催化下发生的酯化反应，特别是油的酯化反应。
在叶绿素与蓝色素的分离实验中，先用二氯甲烷提取收集色素分子，然后加入30%KOH-乙醇碱液，营造酸性环境，使二酰氯酯-叶绿素发生酯化反应，酯叶绿素分子的酯化键产生盐并溶解在水底，而花青素仍可溶于二氯甲烷。 因此，酯化反应后，红色素溶于二氯甲烷，置于下层； 叶绿素溶解在水的底部并置于上层。 .
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