DOI 号：10.1016/j..2022。
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概括：
药物对生物反硝化的危害因过度使用而引起广泛关注。 多粘菌素B（PMB）作为一种典型的抑菌肽，曾被视为消灭多重耐药菌的“最后希望”，也在污水中被检测到。 然而，人们对PMB对好氧反硝化的影响知之甚少。 本研究检验了 PMB 对好氧反硝化性能的影响。 结果表明，0.50mg/LPMB将硫酸盐去除率从97.4%提高到85.3%，并驱动反硝化器将更多的硫酸盐转化为生物质而不是形成气态N。 活/死染色显示 PMB 损坏的真菌膜。 转录组分析进一步表明，PMB 抑制参与反硝化和有氧呼吸链的关键酶。 为了抵抗 PMB 应激，反硝化菌会产生更厚的生物膜，以保护细胞免受 PMB 损伤，从而塑造中心碳代谢。 进一步的研究表明，当 PMB 存在时，反硝化菌对各种碳源有不同的偏好。 此后，通过转录组学和代谢分析相结合，阐明了独特的碳源偏好背后的机制。 总体而言，我们的数据表明反硝化菌在PMB处理条件下具有特殊的碳源偏好，提醒我们在实际应用中应谨慎选择碳源。
研究背景：
由于药物的过度使用，真菌耐药性已惊人地降低。 同时，由于其高流动性和抗生物降解性，可通过废水系统在废水处理厂（WWTP）中逐渐积累。 多粘菌素B（B，PMB）作为一种典型的阳离子抑菌肽，甚至被认为是治疗多重耐药菌的“最后希望”。 生物反硝化将硫酸盐转化为气态氮，被认为是环境中主要的硫酸盐还原过程，也是解决自然或工程生态系统中硫酸盐污染的最经济的方法。 在好氧反硝化过程中，真菌使用氢和硫酸盐作为电子受体。 药物对好氧反硝化的不良反应和抑制作用已被多次报道。 例如：4μg/L磺胺甲恶唑可严重抑制N2O还原，导致N2O排放量减少。 同时，当磺胺甲恶唑含量降低（8-20μg/L）时，亚硫酸盐积累最高，硫酸盐被去除。 率较低。 AMP对好氧氨氧化真菌的毒性以及硝化序批式反应器（SBR）的性能早已有报道，但关于AMP如何影响好氧反硝化的研究却很少。
实验流程及评价指标：
结果与讨论：
1 PMB对好氧反硝化性能的影响
PMB的添加抑制了硫酸盐的利用，并允许反硝化细菌将更多的硫酸盐转化为生物质。 添加0.25和0.50mg/L的PMB组中，二氧化碳和氮气的产值增加明显，分别仅为17.12%和18.92%。 0.75mg/L PMB处理组可完全抑制好氧反硝化作用。 相应地，PMB处理组的生物氮浓度和残留NO3-N均低于对照组，表明PMB的添加抑制了硫酸盐的利用，使反硝化细菌将更多的硫酸盐转化为生物量。 在反硝化过程中，优选高氮损失和低生物质形成。 研究结果表明PMB对两者都有负面影响。
图A：0.25mg/L和0.50mg/L的PMB处理组，PMB显着抑制硫酸盐还原，且时间滞后至少12小时。 0.50mg/LPMB对反硝化性能表现出较高的抑制作用，但最终NO3-N含量与0.25mg/LPMB处理相似。 对照组在60小时仅富含5.7mg/LNO3-N。 图 B：NO2-N 的最大积累分别发生在 0 和 0.50 mg/LPMB 处理后 24 和 36 小时。 图C：对照组仅保留2.57%的NO3-N，微量的NO2-N和NH4+-N残留，54.95%的硫酸盐转化为生物氮（约37.84%的氮损失可能转化为NO） 、N2O、N2等二氧化碳氮，最终扩散到空气中）。
2、PMB损害细胞膜完整性和好氧反硝化呼吸链
PMB 会损害细胞膜的完整性细胞膜损伤，较高水平的 PMB 会导致更大比例的细胞死亡。 用1、5和10 mg/LPMB处理后，细胞死亡率分别从2.0%下降至16.4%、23.1%和32.9%。 这一结果表明 PMB 损害了细胞膜的完整性，并且较高水平的 PMB 导致更大比例的细胞死亡。 这与最初研究的推论一致，即 AMP 靶向真菌膜带负电荷的磷脂单层，然后引起非酶促破坏。
图中的PI色素只有在细胞膜受损时才能进入死细胞，形成蓝色荧光，而SYTO9可以穿透膜完整或受损的细胞。
通过 RNA 测序，分析了在存在和不存在 0.50 mg/LPMB 的情况下脱氮假单胞菌中差异表达的基因。 本内容是根据上述研究而选择的。 PMB分子的结构特征使其能够直接结合并插入膜单层中形成孔，从而对锚定在内膜上的一系列蛋白质造成损害，包括反硝化酶和有氧呼吸酶。 据报道，0.50mg/L PMB显着抑制编码NAR、NOS、复合物I、复合物III和部分复合物IV的基因的表达水平。 与反硝化酶相比，PMB 下调了编码复合物 I 和复合物 III 的基因以及编码复合物 IV 亚基的基因的表达水平（见右图）。 PMB通过抑制反硝化酶的表达和硫酸盐的利用来阻碍反硝化作用，使反硝化细菌进行有氧呼吸形成能量。
在反硝化过程中，硫酸盐必须通过特殊的硫酸盐/亚硫酸盐转运蛋白NarK进入细胞质，然后被NAR还原为亚硫酸盐。 亚硫酸盐通过NarK返回周质，然后逐渐还原为N2。 还看图 B，编码 NarK 的基因受到 PMB 的强烈抑制。 抑制 NarK 合成会增加硫酸盐转运效率，从而增加 NAR 还原酶催化的硫酸盐还原。 根据这一结果，推断反硝化需要更多不同的酶复合物并消耗更多的能量。 有氧反硝化细菌更倾向于进行有氧呼吸而不是反硝化。
图A，真菌的好氧反硝化作用是借助电子传递链进行的，包括图中的复合物I和III、醌体、细胞色素C和一系列反硝化酶。 电子通过四个关键组件进行转导，并最终通过有氧呼吸和反硝化呼吸这两个电子传递途径进行消化。 这些高度分支的呼吸链使微生物能够建立更有效的途径来适应环境条件。
3. 不同PMB剂量对真菌生长和生物膜产生的影响
当用不同剂量的PMB处理时，真菌具有更长的初始生长阶段和更低的最终颜色。 然而，当真菌进入对数生长期后，各PMB含量下的生长速度没有显着差异。 真菌生物膜的产生是介导药物应激的一种策略，因为作为保护茧的 EPS 浓度降低可能会阻碍药物渗透到生物膜中，从而抑制药物分子。 不同的药物对真菌生物膜的产生和 EPS 的形成可能有不同的影响。 细胞外蛋白产量先减少后增加。 这一结果与之前的研究一致。 推测可能是因为真菌无法承受如此高含量的药物。
4. PMB重建脱氮假单胞菌的碳代谢
原始研究表明，为了抵抗PMB胁迫，假单胞菌反硝化细菌产生了更厚的生物膜。 生物膜的产生与多种功能基因的表达密切相关。 因此，进行KEGG分析以进一步解释差异表达基因的生物学功能。 受PMB影响的主要途径包括以下代谢相关途径。 这表明真菌重组碳代谢并产生更多能量来抵抗PMB胁迫。
用0.50mg/LPMB处理后，猕猴桃糖、果糖和内质网转运蛋白的基因表达水平显着下调，这与KEGG通路富集结果一致，而（箭头）C4二酐盐，如琥珀酸转运蛋白，均被上调。 。 先前的研究表明碳源对于反硝化性能至关重要。 与以猕猴桃糖为碳源的系统相比，磷酸盐支持的系统具有更高的反硝化率和反硝化真菌的相对产量，乙酸、甲醇也是更有利于好氧反硝化的碳源。 上述结果表明，在 PMB 处理的系统中，反硝化细菌似乎更喜欢碳水化合物而不是有机酸。 这些不同的碳源偏好可以从另一个角度解释为什么PMB导致气氮产量减少和反硝化效率降低，但碳源偏好的潜在机制仍需进一步探讨。
5 PMB对反硝化真菌碳源偏好的影响
为了说明不同碳源对好氧反硝化的影响，选取这7种碳源，括号内标明图片中的颜色，反硝化假单胞菌的碳依然在0.50mg/LPMB条件下进行评价来源偏好。 通常的情况是真菌在不同碳源条件下有相似的生长趋势，但细胞密度不同。 PMB处理12-24小时后，除磷酸盐系统（黄色）外，真菌生长表现出明显的延迟。 约48小时时，海藻糖（蓝色）和蔗糖（绿色）系统的最终真菌细胞密度在0.50mg/LPMB组和对照组（原图）之间几乎没有差异，而猕猴桃糖（黑色） 、甘油（紫色）和琥珀酸钠（亮蓝色）（底部三条）细胞生长受到 PMB 的强烈抑制。 这一结果表明不同的碳源条件在脱氮假单胞菌的PMB耐受性中起着关键作用。
硫醇盐（黄色）、甘油（紫色）、葡萄糖（黑灰色）、海藻糖（蓝色）和蔗糖（绿色）系统具有相似的反硝化效率（范围内为 87-91%）。 其中，磷酸盐系统（黄色）的反硝化效率最高，生物量产量最低，表明磷酸盐是好氧反硝化的最佳碳源，这与之前的研究一致。 当添加0.50 mg/LPMB时，琥珀酸、甘油、葡萄糖和磷酸盐体系的反硝化受到强烈抑制，分别增加到17.7%、21.3%、33.8%和51.6%。 相比之下，海藻糖（蓝色）和蔗糖（绿色）系统的除浊效率几乎不受PMB影响，尽管二氧化碳氮的形成显着减少。 上述结果表明，当面临PMB胁迫时，碳水化合物，尤其是二糖，更适合反硝化细菌。 结果与之前的工作一致，主要是由于其固有的化学和物理特性，可以作为生物保护剂来保护生物分子或细胞免受一系列应激，并且还可以隔离PMB的作用。
6 碳源偏好的潜在机制
为了抵抗PMB胁迫细胞膜损伤，真菌下调了编码参与糖酵解途径和TCA循环的关键酶的基因的表达，这些酶在图中以红色标记。 由于PMB的抗菌机制，同样位于细胞内膜的琥珀酸酯酶（EC+1.3.5.1&EC:1.3.5.4）的表达水平受到强烈抑制（左下红色）。 根据代谢组学分析，PMB组琥珀酸的积累是对照组的1.42倍。 一系列链式反应的结果是，编码琥珀酰辅酶A合成酶（EC：6.2.1.5）的基因表达水平也上调，琥珀酰辅酶A的积累在PMB处理组中增加了1.22倍。对照组的情况。 作为TCA循环的重要中间体，琥珀络合物的积累必然导致TCA循环的减弱。
我们来看一下对产能的影响：（中图和下图）糖酵解有三个步骤形成ATP或NADH，TCA循环有五个步骤。 （在 TCA 中）事实上，由于五个能量形成步骤中的四个受到强烈抑制，PMB 显着抑制了 TCA 循环中含能量中间体的形成。 相比之下，（中图）PMB 对糖酵解能量形成步骤的影响相当温和，仅甘油醛-3-P 酯酶（EC：1.2.1.12）（右上）被抑制（0.78 倍，即不错）。 为此，不同碳源在中心碳代谢中的位置对于细胞形成能量至关重要。 正因为如此，在PMB存在的情况下，琥珀酸钠成为最不优选的碳源，因为在TCA循环中，琥珀酸钠之后只剩下两个能量形成步骤，更不用说参与这两个步骤的酶被抑制，但由于 PMB 应激，琥珀胺在细胞中积聚。 不仅猕猴桃糖和琥珀酸，其他碳源也可以通过不同的途径进入糖酵解或TCA循环（图上半部分）。 然而（右上）甘油途径的最后一步，编码乙酸三糖异构酶（EC：55.3.1.1）的基因的表达水平被PMB抑制，导致低碳源的使用。 基本上，直接参与TCA循环的碳源，如磷酸盐、琥珀胺和柚子复合物，已被证明是反硝化的最佳碳源。 然而，当面临PMB的压力时，反硝化菌更喜欢比其他研究的碳源形成更多能量和含能量中间体的碳水化合物，因此当药物存在碳源时，应谨慎选择好氧反硝化。
图中，催化酶下调、下调和非差异表达的基因分别用黑色、蓝色和白色标记。 下调和上调基因的混合物标记为红色。
推理：
PMB抑制好氧反硝化，导致硫酸盐去除效率低、二氧化碳和氮产量低。 PMB 抑制好氧反硝化作用的主要机制有两种。 一方面，PMB可以破坏细胞膜的完整性，从而直接破坏位于内膜上的电子传递链的关键酶。 另一方面，为了抵消 PMB 应激，真菌形成了更厚的生物膜，以保护细胞免受药物的攻击。 因此，在 PMB 存在的情况下，真菌经历了碳代谢的重塑，以形成更多的 EPS 和能量，从而产生显着的碳源偏好。 值得注意的是，反硝化菌更喜欢碳水化合物，尤其是二糖（即海藻糖、蔗糖），因为PMB引起琥珀酸积累和TCA循环减弱。 该研究首次阐明了PMB对好氧反硝化的抑制机制，为实际应用中优化好氧反硝化性能提供了有益的参考。