摘要:抑菌肽相比传统药物,具有低毒灭菌、对多重耐药菌有效、生物相容性好等优点。近些年来,抑菌肽奇特的细胞膜靶点作用机制得到了深入研究,基于此机制上的结构优化策略也成为了近日研究热点。本文主要针对抗菌肽的细胞膜损伤机制展开,就近期通过多肽替换、线性肽成环、化学修饰、多聚化、抗生素偶联以及复合材料制备等手段对抗菌肽结构给以优化的研究进展进行了总结,期望对抗菌肽设计与改构研究提供思路。
抑菌肽(,AMPs),有时也被称为寄主防御肽(host,HDPs),是一种小分子氨基酸,一般由不到50个多肽残基组成。抑菌肽具有低毒的抗微生物活性,不仅抑菌活性外,对细菌、寄生虫与病毒也有活性[1-3],再者,抑菌肽也被发觉具有其他多种生理功能,如免疫调节、促血管产生、促创口结疤和抗肺癌活性等[4-7]。天然抑菌肽来源广泛,不仅人体外,在植物、植物、细菌、真菌乃至古生菌与原生植物中均发觉了天然的抑菌肽[8]。目前早已报导了超过4000种抑菌肽[9],其中大多数为带有正电荷、具有一定疏水性官能团的两亲性氨基酸,主要通过影响真菌细胞膜发挥抑菌作用。抑菌肽的构型多样,可以是α-螺旋、β-折叠,线性延伸或无规则蜷曲,也可以是环肽或上述多种官能团的混和,但大部份抑菌肽的构型为α-螺旋或β-折叠。因为现今微生物对传统药物的耐药性越来越强,临床对新型抑菌抗生素需求迫切,而抑菌肽由于具有与传统药物所不同的抑菌机制,成为了一种拥有巨大潜力的新型抑菌分子类别,在近些年来遭到了广泛关注,但是在真菌感染、伤口结疤与发炎医治等方面都具有临床应用前景[10-11]。本文从传统药物与抑菌肽的抑菌机制出发,剖析了抑菌肽基于细胞膜损伤机制的抑菌构效关系,并对近些年来基于细胞膜损伤机制的一些抑菌肽结构优化策略研究进展进行了介绍。
1传统药物与抑菌肽的抑菌机制
传统药物一般是通过5种途径实现对病原真菌的功击[12]:①抑制真菌细胞壁的合成(β-内丙酯类药物等);②抑制真菌蛋白质合成(地塞米松等);③直接或间接抑制核苷酸(DNA/RNA)的合成或复制(利福霉素、磺胺类药物等);④靶向细胞膜(多黏菌素等);⑤前4种机制与药物诱导的应激反应协同作用,如DNA修补的SOS应答氧化应激等(β-内丙酯类药物等)。而针对上述作用机制,具有抗药性的真菌进化出了对应的药物抵抗机制[13-15]:①产生使抑菌抗生素失活的酶(针对β-内丙酯药物等);②通过外排泵将药物泵出菌体外(针对黄连素等);③改变原先对药物的作用靶位(针对β-内丙酯药物等)以及增加真菌细胞膜私密性、改变代谢通路等机制。面对具有多种耐药机制的超级真菌,传统药物的抑菌疗效大大减少。
抑菌肽的抑菌机制主要通过细胞膜与细胞内两种途径实现[15-16]。抑菌肽的细胞内途径与传统的药物作用机制相像,主要通过与真菌细胞内的各类大分子互相作用而影响细胞功能来实现,如影响核苷酸复制、蛋白质合成、影响酶活性和细胞壁生成等[15-16]。
细胞膜途径是抑菌肽的主要抑菌途径,也是其与传统药物不同的特有途径。带有正电荷的抑菌肽与真菌带有负电荷的细胞膜通过静电吸附相结合,集聚在真菌细胞膜表面;抑菌肽两亲性结构中的疏水部份与细胞膜磷脂互相作用,破坏真菌的细胞膜,引起细胞死亡,进而实现抑菌。对于抗菌肽与真菌细胞膜的互相作用机制,目前还未能完全阐述,有多种常见的模型假说[16],如桶-板模型、环-孔模型、地毯模型和集聚模型。在桶-板模型中[17],随着抑菌肽在细胞膜表面集聚,其垂直插入脂类双分子层中,疏水部份朝外,亲水部份朝内产生通道,导致细胞内物质流出;环-孔模型与桶-板模型相像[17],不同的是在环-孔模型中抑菌肽的疏水部份与细胞膜脂类层相结合,共同环绕着富含抑菌肽亲水部份的凹坑;在地毯模型中[18],抑菌肽完全平行覆盖在细胞膜表面,随着抑菌肽不断集聚,细胞膜磷质层稳定性增加,最后完全被抑菌肽覆盖并断裂;在集聚模型中[19],抑菌肽与细胞膜互相结合,覆盖细胞膜造成其断裂的同时也产生造成细胞内物质泄露的孔道,这种孔道会进一步帮助抑菌肽步入细胞内,实现与传统药物分子相像的对核苷酸、蛋白质、酶等合成进行抑制的功能。无论是哪种模型,抑菌肽都还能使细胞膜穿透性大大降低,引起细胞溶化、胞内物质流出,引起细胞死亡。抑菌肽通过细胞膜途径引起真菌细胞死亡的生物活性与其结构密切相关,对抗菌肽的结构特征上的研究早已有了一定成果。
2抑菌肽的结构-生物活性关系
抑菌肽的抑菌活性与其结构联系紧密,这些基于细胞膜损伤机制的抑菌活性为抑菌肽结构修饰优化提供了方向,其中在结构上对抗菌活性影响较大的几个诱因包括电荷数、疏水性、螺旋度与两亲性等。
适当降低抑菌肽的正电荷数才能提升其抑菌活性[20]。绝大部份抑菌肽在中性pH下都为阳离子型,带正电荷,借此通过静电互相作用附着在真菌带负电的细胞表面。据悉,正电荷还能否使抑菌肽与细胞膜脂寡糖上的Ca2+、Mg2+结合位点结合,深入细胞膜内部,进一步破坏细胞膜结构[21]。真菌细胞的脂类膜作为抑菌肽作用的主要靶向,抑菌肽的疏水性对其与脂类膜的互相作用有着重要影响。通过引入疏水性残基细胞膜损伤,提升抑菌肽的疏水性,可以提升其抑菌活性。但过强的疏水性也会引起抑菌肽的自我集聚,增加其溶化度与抑菌活性[22]。大多数的抑菌肽有着α-螺旋的二级结构,抑菌肽在α-螺旋下才能更好地与细胞膜相结合,因而抑菌肽的螺旋度被觉得与其抑菌活性有较强的相关性[22]。最后,两亲性是绝大多数抑菌肽具有的特点,其本身也是抑菌肽在电荷数与疏水性上取得平衡的结果,意味着抑菌肽既才能通过亲水域的静电作用吸附在细胞膜,也可以通过疏水域与细胞膜的互相作用溶入膜结构中,呈现抑菌活性。
3抑菌肽的近日临床前结构优化研究进展
针对上述几个方面,通过优化抑菌肽的多肽序列就能改善其抑菌活性。据悉,其他的物理修饰手段,如C端丙酯化、N端胺基化、订合成环(借助小分子联接子,共价交联不同位置多肽的胺基,提升氨基酸稳定性等属性)、烷基链引入等方式[23-24]也被广泛应用于抑菌肽结构整修,借此达到高抑菌活性、提高氨基酸稳定性和减少溶血毒性等目的。下文将会介绍近些年来通过疏水性、正电荷调整和其他物理修饰手段对抗菌肽进行优化的临床前研究进展。
3.1多肽替换
对抗菌肽序列中的多肽进行替换、优化,借此调控氨基酸电荷、疏水性和二级结构等属性,进而实现更好的抑菌疗效、更低的毒性或更高的稳定性,仍然是抑菌肽临床前研究中的主要内容。等[25]通过对人源抑菌肽LL37上C端的24个多肽序列进行随机替换和计算机活性预测,再将序列中的谷氨丙酯替换为阳离子的赖谷氨酸或精谷氨酸,增强其正电荷数和螺旋度,筛选合成了25个氨基酸衍生物,其中的抑菌肽对多种多重耐药菌都具有良好的抑菌疗效,其在50%血清中对金红色猕猴桃杆菌的99.9%灭菌含量LC99.9可达1.6~12.8μmol/L,而改构原型LL-37的相应LC99.9则要小于204.8μmol/L。在血清中的灭菌疗效优于多种临床前和临床研究阶段的抑菌肽抗菌水平。
Deber等[26]从稀有的含连续多个阳离子多肽序列的天然抑菌肽出发,设计合成了富含“阳离子簇”的抑菌肽6K-F17,通过改换赖谷氨酸位置改变该氨基酸电荷分布,调整其两亲性,以探究两亲性对生物活性的影响。研究发觉,即使电荷分布更平均、两亲性更好的结构具有更高的抑菌活性,但对人体正常细胞的毒性也会急剧降低,且抗酶解稳定性也会升高。N端富含连续6个赖谷氨酸,正电荷集中的6K-F17破坏真菌细胞膜能力强,对人细胞毒性低,有着更好的抑菌选择性。6K-F17对铜绿假单胞菌的MIC为3.1~25μmol/L,而6个赖谷氨酸分散在氨基酸序列中的1K-5K抑菌肽的相应MIC则为25~>50μmol/L。6K-F17也拥有更低的毒性和更好的氨基酸稳定性,在其40μmol/L含量下未观察到细胞溶血,且在血清中保留24h后抑菌肽浓度仍然无减轻。
倪京满等[27]基于蛇毒抑菌肽设计合成了一系列疏水或亲水多肽替换的短链衍生物,对衍生物的生物活性与其正电荷、疏水性、两亲性和二级结构间的关系进行剖析,发觉这种衍生物的阳离子多肽与疏水多肽各自分布在α-螺旋二级结构的疏水面与亲水面上。作者总结了抑菌肽衍生物疏水性分别对革兰阳性和阴性菌抑菌活性的影响,筛选出了具有最高抑菌活性和广谱性的抑菌肽A-21,其对金红色猕猴桃杆菌和鲍曼不动弧菌的MIC95可达4~8μmol/L,优于的256~512μmol/L;同时A-21的最低溶血含量MHC(抑菌肽引起10%人血红细胞溶血所需含量)为134.38μmol/L,溶血毒性较低。
单田镇等[28]借助甘氨酸基团上吡啶pH敏感的质子化性质,以西非蜈蚣毒素中的抑菌肽为模板,使用谷氨酸取代赖谷氨酸设计并筛选出了具有碱性pH响应能力的抑菌肽F5。抑菌肽F5在pH7.4的生理pH下对革兰阳性菌的灭菌能力微弱,MIC>64μmol/L,而在pH6.5的微酸性pH下相应抑菌活性显著提高,MIC可达2~16μmol/L。据悉,模板在pH7.4或6.5时MHC为16或2μmol/L,而F5的MHC要小于128μmol/L。在发炎环境下细胞膜损伤,F5可以有效杀伤处于碱性pH中的有害病菌,同时避开了对正常生理pH中有益共生菌的伤害。
3.2线性肽成环
不仅常规的多肽替换优化方式,将线性肽通过二硫键、订合等方式成环的手段在提升抑菌肽活性、稳定性等方面也有着广泛应用。赖仞等[29]以金环蜂毒中的抑菌肽衍生物-BF15为基础,使用色谷氨酸与赖谷氨酸替换原氨基酸中的所有苯丙谷氨酸、丝氨酸和亮谷氨酸,再插入半胱谷氨酸(Cys)成环,得到了具有保留强效抑菌活性、低溶血性的同时具有更高稳定性的抑菌肽ZY4,其对具有多重耐药性的铜绿假单胞菌和鲍曼不动球菌造成的MIC可达0.8~4.0μmol/L;而ZY4的MHC小于320μg/mL,溶血毒性较低。据悉,在血清中保存10h后,ZY4仍然有91%保持结构稳定。
等[30]对天然抑菌肽蛙皮素II进行订合修饰,筛选了不同位点的i+4与i+7(将i与i+4或i与i+7位两个多肽的胺基联接)订合肽,对比其抑菌活性与红细胞溶血度,并对不同位点订合的抑菌肽疏水面进行剖析,结合计算机辅助设计了抑菌肽筛选算法。通过算法确定在15位多肽订合后,再依照算法使用赖谷氨酸扫描在9位将谷氨酸替换为赖谷氨酸(A9K),使其在25μg/mL含量时的细胞溶血由13%增加到3%。然后作者再对已有订合肽在细胞膜上产生环-孔的具体机制进行了剖析,以建立算法。作者进一步在Mag(i+4)15(A9K)的基础上,在1位多肽上降低一处订合以提升稳定性,最后对剩余位点多肽进行替换调整,通过算法帮助筛选出了具有最优的抗多重耐药菌活性、低溶血性、低毒性和高稳定性的双订合抑菌肽Mag(i+4)1,15(A9K,B21A,N22K,S23K),其对铜绿假单胞菌的MIC可达1.56μg/mL,而筛选前Mag2抑菌肽的相应MIC则小于50μg/mL。
3.3非多肽结构引入的物理修饰
向氨基酸中引入非多肽结构(如脂肪链等)来实现对抗菌肽性能的调控也是常用的技巧之一。等[31]将C2-C14酰基链或芳香环引入人源抑菌肽LL37的片断肽KR12-NH2的N端,以研究这些亲脂性修饰对抗菌活性和溶血性的影响。研究发觉,在适当厚度范围(C6-C12)内,N端氨基链修饰才能降低KR12-NH2的抑菌活性;但过长酰基链修饰(C14)的氨基酸会自组装为更大的集聚结构,反倒会造成抑菌活性增长。经过对比,抑菌活性与溶血性取得平衡的最优结构为C8酰基链N端修饰的抑菌肽C8-KR12-NH2,其对于金红色猕猴桃杆菌的MIC可达2~4μg/mL,而无巯基链修饰的Ac-KR12-NH2相应MIC小于256μg/mL。同时,C8-KR12-NH2的MHC为64μg/mL,而更长酰基链(C10-C14)修饰的KR12-NH2在相同含量下则会引起85%~100%的细胞溶血。
3.4单体多聚化
将单体抑菌肽二聚化或多聚化对扩充低毒性、提高抑菌活性和稳定性都有一定帮助,是一种有效的修饰手段。Wade等[32]通过二硫键、二乙酯或全氟苯联接Cys的方式,对先期研究中通过各类物理修饰手段得到的富脯谷氨酸抑菌肽Chex1-Arg20进行了二聚化。研究发觉,使用四氟苯和八氟吡啶联接的抑菌肽二聚体对多重耐药的鲍曼不动链球菌和的抑菌活性分别可达5μg/mL和13.5μg/mL,而Chex1-Arg20单体的相应抑菌活性为200μg/mL和小于250μg/mL。据悉,Chex1-Arg20二聚体还被发觉才能减轻真菌感染引起的发炎和提升寄主先天免疫。
3.5抑菌肽与小分子药物偶联
将抑菌肽与小分子药物通过联接子进行共价偶联,借助抑菌肽靶点真菌细胞膜,再切断抑菌肽与药物间的共价联接释放活性小分子药物,还能同时结合小分子的细胞内灭菌功能与抑菌肽的低毒灭菌和针对多重耐药菌的高活性特性,获得比以上二者单纯联用更好的抑菌疗效。等[33]在爪蟾抑菌肽类似肽9P2-2和富脯谷氨酸抑菌肽两种氨基酸的端与N端分别引入Cys,再通过二硫键或酸酐键与氨苄西林衍生分子共价联接,得到了可切断或不可切断的抑菌肽-小分子药物偶联分子。通过筛选发觉,9P2-2在N端引入Cys后再通过二硫键联接氨苄西林衍生分子的偶联分子Amp-SS-9P2-2在抗革兰阳性菌的活性上有着明显增强。针对具有耐药性的鲍曼不动弧菌,Amp-SS-9P2-2的MIC可达2.5μmol/L,高于单独使用氨苄西林时的320μmol/L或单独使用9P2-2的10μmol/L,而同剂量的氨苄西林与9P2-2单纯联用时MIC也只能达到10μmol/L。
3.6与其他材料聚合
将抑菌肽与其他材料相聚合,产生复合材料,可以突出抑菌肽的低毒抑菌优势,填补其价钱较高昂、具有潜在毒性等缺陷,并同时实现其他材料的功能。程飚等[34]将抑菌肽通过端基与异戊二烯的酰基与透明质酸(HA)的甲基通过酯化反应结合,再与氧化蓝莓糖(ODEX)和富血小板血清簇(PRP)通过席夫碱交联制成水凝胶ODEX/HA-AMP/PRP,用以帮助慢性感染的创口结疤。这些包含抑菌肽在内的多组分水凝胶将各组分功能整合,在包裹创口后可以平缓释放抑菌肽和PRP,通过抑菌肽灭鼠真菌减轻发炎,通过PRP推动胶原增殖收缩和血管生成。在糖尿病创口感染的大鼠模型中,ODEX/HA-AMP/PRP显著抑制了创口处的真菌生长,处理3d时创口处的铜绿假单胞菌和金黄猕猴桃杆菌数目为106数目级,显著优于单纯纱布包扎处理情况下的108数目级;ODEX/HA-AMP/PRP也推动了创口结疤速率,处理14d的创口面积减少为开始的10%左右,显著优于单纯纱布包扎处理情况下的50%。
3.7引入纳米载体
最后,使用纳米载体加载抑菌肽用于体内递送,才能克服抑菌肽的酶解不稳定性和脱靶毒性等缺点,进而提升抑菌肽的药代动力学与药效数据[35]。Lee等[36]使用DSPE-PEG修饰HnMc抑菌肽中Cys的羧基氨基,再将修饰后的DSPE-PEG-HnMc与PLGA-PEG以质量比2:8共同自组装,产生了平均粒径为60nm的HnMc纳米络合物。该纳米络合物中,疏水的PLGA与DSPE被包裹在络合物中心,亲水的PEG和HnMc抑菌肽分布在表面,从而可以主动靶点并破坏真菌的细胞膜;而同在微球表面的PEG链则可以保护HnMc抑菌肽免受非特异性蛋白的吸附和降解。HnMc纳米络合物在0.1mg/mL的含量下也就能对耐药的铜绿假单胞菌和金黄猕猴桃杆菌实现80%的生长抑制疗效;HnMc纳米络合物的MHC为1mg/mL,毒性较低;在耐药铜绿假单胞菌脑部感染的大鼠模型中,HnMc纳米络合物成功延长了大鼠的生存时间,在2.5mg/kg剂量下生存时间由不经处理的6d延长到16d以上。
上述研究中所涉及的多肽序列及修饰手段总结可见表1。不仅以上提到的多肽替换或物理修饰手段外,使用D构象或其他非天然多肽替换、聚乙二醇或糖基化修饰等方式均为抑菌肽结构优化常见思路[12,37]。
4推论与展望
本文主要综述了抑菌肽作用机理、结构优化思路和近些年来的临床前研究进展。相较于传统药物,抑菌肽主要针对细胞膜的作用机制在抑菌低毒性与抗多重耐药性上具有显著优势。通过多种修饰手段对抗菌肽进行结构优化的思路,如物理修饰和计算机辅助筛选等方式,在抑菌肽研究中早已得到了广泛应用。虽然上述结构优化手段在临床和产业化阶段应用还未全面推广,但随着针对耐药菌的新型抑菌抗生素需求的不断减小,具有低毒性、对耐药菌高活性和高生物相容性优点的抑菌肽将来必然会成为临床研究热点。